Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
РНКаза Н 1 1 1
Т4-ДНК-лигаза
Qp-Репликаза Амплифицированная РНК
жит модифицированного нуклеотида. Зато тиолированный dCMP присутствует в нижней цепи, и она по этой причине остается интактной (этап 7). ДНК-полимераза связывается с одноцепочечным разрывом и начинает синтез новой цепи ДНК, вытесняя старую из дуплекса (этапы 8-10), что приводит к воспроизведению конструкции (7) и весь процесс повторяется. Вытесненные цепи связываются с комплементарными им праймерами S2 и В2, выполняя роль матриц в синтезе ДНК, что обеспечивает экспоненциальный характер амплификации анализируемой последовательности.
Современные варианты SDA-амплификации могут быть реализованы в формате реального времени, а также на микроэлектронных чипах [238] и активно используются для проведения ДНК-диагностики возбудителей инфекционных заболеваний таких, как Chlamydia trachomatis и Neisseria gonorrhoeae.
Использование Qp-репликазы для амплификации нуклеотидных последовательностей. Этот способ амплификации осуществляется на уровне РНК с использованием РНК-репликазы, которая обычно участвует в репликации геномной РНК колифага Q(3 [329]. Соответствующие РНК-матрицы могут быть получены субклонированием требуемых последовательностей в виде фрагментов ДНК, внедренных в последовательности Qp-ДНК под контроль промотора Т7-РНК-полимеразы в подходящем векторе. С помощью Т7-РНК-полимеразы на ДНК-матрице такого плазмидного вектора можно получать копии РНК, которые будут служить матрицами при синтезе РНК Qp-репликазой in vitro. При более общем подходе к реализации этих идей получают два РНК-зонда, которые гибридизуются с соседними последовательностями анализируемой РНК таким образом, что между ними остается одноцепочечный разрыв, который может быть ликвидирован с помощью Т4-ДНК-лигазы. Оба зонда по отдельности не могут реплицироваться Qp-репликазой, однако, после ковалентного соединения в составе объединенной молекулы становятся для нее хорошей матрицей (рис. 30).
Процесс репликации Qp-PHK характеризуется рядом уникальных черт. Для него не требуются праймеры, и во время синтеза новых цепей РНК не образуется промежуточных двухцепочечных молекул. Фермент распознает на реплицируемой РНК специфические последовательности и элементы вторичной структуры, после чего делает копии соответствующих участков РНК, комплементарные исходной матрице, которые отделяются от матрицы в процессе их синтеза, формируя свою собственную стабильную пространственную структуру. Эти
Сравнительные характеристики основных методов амплификации нуклеиновых кислот in vitro
Метод Амплифици- Используемый темпера Требуемое ко Уровень ам
руемая после турный режим (°С) личество зон плификации
довательность дов
PCR Матрица 50-98, циклически 2 или более ю12
QJ3R Зонд 37, изотермально 1 ю9
LCR Зонд 50-98, циклически 4 ю5
3SR Матрица 42, изотермально 2 ю10
SDA Матрица 37, изотермально 4 ю7
Примечание. QPR-QP-репликация, LCR - лигазная цепная реакция, 3SR-
изотермическая самоподдерживающаяся репликация последовательностей, SDA -
амплификация с замещением цепи ДНК
элементы структуры также обеспечивают репликацию вновь синтезированной РНК Qp-репликазой. Таким образом, фермент одновременно реплицирует родительские и дочерние цепи РНК, что приводит к амплификации соответствующих последовательностей.
Синтез РНК, осуществляемый Qp-репликазой, характеризуется очень высокой эффективностью. В общем случае удается получать 107-108 копий исходной последовательности. При этом репликация может начинаться с одной молекулы. Однако реализация этого метода сталкивается с рядом технических трудностей. В частности, сама QP-репликаза является сложноустроенным четырехсубъединичным ферментом и не всегда доступна. Кроме того, имеется целый ряд ограничений, накладываемых на последовательности анализируемой РНК, что вызвано соблюдением структурных особенностей молекул, распознаваемых репликазой. Все это ограничивает широкое распространение системы в анализе ДНК. Тем не менее, этот подход в будущем может оказаться весьма полезным в тех случаях, где требуется очень высокий уровень амплификации последовательностей при постоянной температуре, а в настоящее время он успешно используется для обнаружения РНК вируса иммунодефицита человека.
Основные характеристики всех рассмотренных выше отличающихся от ПЦР методов амплификации нуклеиновых кислот представлены в табл. 10 [330].
6.6.3. Амплификация по типу катящегося кольца
В заключение этой главы кратко рассмотрим уже упомянутый метод изотермической амплификации нуклеиновых кислот, осуществляемой на кольцевых ковалентно замкнутых молекулах ДНК по типу катящегося кольца (rolling circle amplification -RCA) [331]. В методе линейной RCA используется один праймер, комплементарный кольцевой одноцепочечной ДНК, которая может быть получена денатурацией исходных двухцепочечных молекул. Синтезировав комплементарную цепь, ДНК полимераза начинает вытеснять 5'-конец синтезированной цепи из гибрида, причем процесс продолжается непрерывно на протяжении всей реакции, во время которой фермент совершает множество оборотов вокруг амплифицируемой кольцевой матрицы. Продуктом RCA является длинная одноцепочечная ДНК, в которой мономеры, комплементарные исходной кольцевой молекуле, следуют друг за другом в виде конкатемера. Поскольку в этом случае гигантская молекула ассоциирована с единственным праймером, метод RCA с успехом используется для амплификации сигнала на микроматрицах [331]. При этом на двумерных и трехмерных микроматрицах имеет место возрастание сигнала в 10 ООО раз по сравнению с сигналом, получаемым от отдельного зонда, меченного флуоресцентным красителем. Ковалентное связывание 5'-концов праймеров для RCA с антителами позволяет обнаруживать белки в концентрации до 0,1 пг/мл анализируемой жидкости [332, 333].
