Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Патрушев Л.И. -> "Искусственные генетические системы. Том 1" -> 43

Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.

Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Том 1 — М.: Наука, 2004. — 256 c.
Скачать (прямая ссылка): iskusstvenniegeneticheskie2004.djvu
Предыдущая << 1 .. 37 38 39 40 41 42 < 43 > 44 45 46 47 48 49 .. 221 >> Следующая

вательность является усредненной последовательностью, которая чаще всего встречается в генах Е. coli, а /^-промотор фага X - одним из наиболее сильных природных промоторов, функционирующих в этой бактерии. Из приведенных последовательностей видно, что ни одна из критических последовательностей природных промоторов не идентична консенсусной последовательности, что указывает на возможность изменения последовательности нуклеотидов промоторов для дальнейшего повышения эффективности их функционирования. Действительно, знание основных принципов строения и функционирования промоторов позволяет конструировать новые промоторы, которые по своей эффективности могут превосходить природные. Примером такого промотора, используемого в некоторых экспрессирующих векторах, является промотор Taq, который в своем составе объединяет последовательности промоторов лактозного и триптофанового оперонов Е. coli.
В клетках Е. coli (и других бактерий) транскрипция большинства генов носит регулируемый характер, что обеспечивается системой белков-репрессоров и активаторов, а также низкомолекулярных эффекторов, которые главным образом влияют на взаимодействие РНК-полимеразы с транскрибируемыми генами [119-121]. Необходимость регулирования экспрессии генов в генной инженерии диктуется прежде всего тем, что сверхэкспрессия клонированных генов в клетках-продуцентах рекомбинантных белков при использовании сильных конститутивных промоторов может отрицательно сказываться на их жизнеспособности, поскольку промежуточные и конечные продукты экспрессии часто обладают цитотоксическим действием [122]. В этом случае сверхэкспрессия клонированных генов сопровождается снижением скорости или даже полной остановкой роста бактериальных или иных клеток. Для предотвращения этих эффектов используются генно-инженерные конструкции, в которых экспрессия клонированных генов в значительной степени подавлена (репрессирована) на ранних фазах роста культуры рекомбинантных клеток и может быть дерепрессирована в любой нужный момент времени.
В качестве примера рассмотрим три системы регулируемой экспрессии рекомбинантных генов в клетках Е. coli, которые получили широкое распространение. В одном случае для контроля экспрессии клонированных генов используют хорошо изученную систему регуляторных элементов лактозного оперона [123], в другом - систему промотор-репрессор-оператор фага X [124], в третьем - промоторы и РНК-полимеразы бактериофагов [125]. Принцип регуляции экспрессии рекомбинантных генов в первых двух случаях один и тот же. В векторные молекулы вводятся регуля-
дррные последовательности фага X или /ас-оперона, за которыми следуют последовательность нуклеотидов полилинкера с несколькими уникальными сайтами рестрикции, по которой проводится клонирование гена. Одновременно в тот же вектор вводится ген-регулятор, кодирующий белок-репрессор. В отсутствие индуцирующего воздействия молекулы репрессора, ген которого экспрессируется конститутивно, связываются с оператором, тем самым препятствуя взаимодействию РНК-полимеразы с промотором, под контролем которого находится клонированный рекомбинантный ген. Это приводит к резкому снижению уровня транскрипции клонированного гена, низкому внутриклеточному содержанию соответствующей мРНК и белкового продукта ее трансляции.
Существенным различием двух систем регулируемой экспрессии является способ их индукции. В случае регуляторной системы lac-оперона чаще всего используют синтетический аналог природного индуктора (алло-лактозы) - изопропил-р-О-тиогалакто-пиранозид (IPTG). Индуктор связывается с молекулой репрессора и нарушает его взаимодействие с операторным участком ДНК. Область /ас-промотора становится доступной для РНК-полимера-зы, которая с высокой эффективностью начинает транскрибировать гены, расположенные вслед за промотором. В отличие от этого в системе репрессии-дерепрессии фага X используют ген репрессора с1857, содержащий температурочувствительную мутацию. Наличие такой мутации приводит к тому, что мутантный бе-лок-репрессор сохраняет свою нативную конформацию, а следовательно, и способность подавлять синтез РНК только при пер-миссивной температуре (как правило, 28-30°С). При повышении температуры окружающей среды до 42°С происходят инактивация белка-репрессора и дерепрессия генов, расположенных под контролем промоторов PL или PR фага X.
Использование системы репрессии-дерепрессии, чувствительной к температуре, в ряде случаев более технологично по сравнению с химической индукцией по двум обстоятельствам: во-первых, это менее дорогой способ индукции; во-вторых, для системы фага X характерна более высокая степень репрессии генов, находящихся под ее контролем, и, соответственно, более низкий базальный уровень их экспрессии. Такой фактор становится решающим при клонировании и получении экспрессии генов, белковые продукты которых токсичны для клетки-хозяина. Однако, несмотря на технологичность системы репрессии-дерепрессии, чувствительной к температуре, сверхпродукция рекомбинантных белков, особенно эукариотических, часто сопровождается внутриклеточным образованием их нерастворимых агрегатов, что в
Предыдущая << 1 .. 37 38 39 40 41 42 < 43 > 44 45 46 47 48 49 .. 221 >> Следующая
Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed