Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
ряде случаев полностью отсутствует при использовании для выращивания рекомбинантных клеток температур ниже 30°С (подробнее см. ниже). Эти эффекты накладывают ограничения на использование векторов с температурочувствительным контролем экспрессии для продукции эукариотических и в меньшей степени прокариотических белков в бактериальных клетках.
Самый сильный уровень репрессии рекомбинантного гена в бактериальных клетках обеспечивает система транскрипции с участием фагоспецифических РНК-полимераз Т7, ТЗ и SP6 (TV-подобный фаг Salmonella), что особенно важно при клонировании генов белков, токсичных для клеток-хозяев, таких как колицины, эндо- и экзонуклеазы, протеиназы и т.п. Нечетные Т-фаги и SP6 кодируют просто устроенные (односубъединичные) РНК-полимеразы, которые осуществляют транскрипцию большей части поздних генов этих вирусов. При этом фаговые ферменты очень эффективно используют собственные промоторы, которые совершенно не распознаются РНК-полимеразой Е. coli из-за особенностей первичной структуры. Поэтому в отсутствие фаговых РНК-полимераз транскрипция генов, клонированных под контролем фаговых промоторов, полностью блокирована. В таких системах индукцию рекомбинантных генов осуществляют двумя способами. В одном случае рекомбинантными плазмидами трансформируют штамм Е. coli, лизогенный (т.е. содержащий в своей хромосоме интегрированную фаговую хромосому) по фагу DE3, производному X, обладающему областью иммунности фага 21, геном Т7-РНК-полимеразы под контролем /ас?/К5-промотора и геном lac-репрессора lacl [126]. Индукция транскрипции гена Т7-РНК-полимеразы осуществляется искусственным индуктором /ас-оперона IPTG. В присутствии IPTG в клетках нарабатывается Т7-РНК-полимераза, которая с высокой эффективностью начинает транскрибировать рекомбинантный ген.
Уровень репрессии гена Т7-РНК-полимеразы в системе, рассмотренной выше, бывает недостаточным для предотвращения летального действия очень токсичных рекомбинантных белков на клетку-хозяина. В этом случае для индукции рекомбинантного гена может быть использовано заражение клеток, содержащих экспрессирующий вектор, фагом СЕ6, который содержит в своей хромосоме ген Т7-РНК-полимеразы, под контролем ^-промоторов PL и PR, регулируемых температурочувствительным репрессором с1857. После заражения таким фагом рекомбинантных клеток и индукции гена Т7-РНК-полимеразы транскрипция рекомбинантных генов происходит настолько эффективно, что это предотвращает нормальное развитие самого фага. Оба типа систем имеются в продаже и распространяются фирмой Novagene (США).
Для обеспечения регулируемой тканеспецифической экспрессии рекомбинантных генов в соматических клетках животных и растений в составе векторов используют энхансеры, которые избирательно стимулируют транскрипцию в соответствующих тканях и не оказывают такого действия на гены в тканях, клетки которых не экспрессируют необходимые регуляторные белки. Кроме того, популярным становится введение в экспрессирующие эукариотические векторы пограничных последовательностей нуклеотидов, фланкирующих клонируемые гены, которые помогают обеспечивать экспрессию рекомбинантных генов, сводя к минимуму эффект их положения в хромосомах соматических клеток.
Наряду с промоторами векторы, экспрессирующие рекомбинантные гены в клетках Е. coli, должны содержать и гомологичные терминаторы транскрипции. Необходимость в этом вызвана тем, что даже нетранслируемые избыточные 3'-концевые последовательности нуклеотидов мРНК, транскрибированной с рекомбинантного гена, отрицательно сказываются на эффективности ее трансляции, что, по-видимому, связано с участием таких последовательностей в образовании сложной третичной структуры рекомбинантных мРНК.
3.6.2. Факторы, влияющие на эффективность экспрессии рекомбинантных генов в бактериальных клетках: трансляция
Как следует из изложенного выше, уровень экспрессии клонированных генов в бактериальных и эукариотических клетках во многом зависит от эффективности их транскрипции, т.е. от уровня внутриклеточного содержания соответствующих мРНК. Однако экспрессия рекомбинантных генов не в меньшей степени зависит и от эффективности трансляции таких мРНК рибосомами, поскольку процесс передачи генетической информации природных генов и на этом уровне является объектом многочисленных регуляторных воздействий [127]. При работе с рекомбинантными ДНК чаще всего приходится иметь дело с гетерологичны-ми системами, в которых клонированные экспрессируемые ДНК чужеродны по отношению к генетическому окружению и ферментативным системам бактериальных или эукариотических клеток-хозяев. Поэтому всегда необходимо учитывать уровень Соответствия регуляторных факторов клеток-хозяев регуляторным последовательностям мРНК, которые являются транскриптами рекомбинантных генов. В частности, на эффективность Трансляции чужеродных мРНК в бактериальных клетках оказы-
вает сильное влияние первичная структура небольшого участка 5'-концевой части мРНК перед инициирующим AUG-кодоном, частично комплементарная 3'-концевой части 16S рРНК. Этот участок мРНК называют последовательностью Шайна-Далъ-гарно, или SD-последователъностъю [128, 129].
