Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
SD-последовательность мРНК служит сигналом для взаимодействия рибосом с мРНК и обеспечивает инициацию трансляции с правильного AUG-кодона. Она представляет собой короткую последовательность нуклеотидов, обогащенную пуриновыми основаниями, и расположена за 4-9 нуклеотидов перед AUG-кодоном:
16S рРНК hqAUUCCUCCACUAGG................5'
lacZ-мР Н К uucac ас AGG aaacagcuaugaccaugauu • • • • 3'
(в приведенном примере прописными буквами у lacZ-мРНК изображена SD-последовательность нуклеотидов, комплементарная соответствующей пиримидиновой последовательности 16S рРНК, и подчеркнут инициирующий кодон). Различия в эффективности распознавания такого сайта на мРНК рибосомами приводят к различиям в уровнях экспрессии соответствующих генов. Достаточно наличия в SD-сайте трех нуклеотидов, комплементарных соответствующему участку 16S РНК, чтобы рибосомы приобретали способность связывать эту мРНК. Помимо SD-последовательнос-ти в мРНК, по-видимому, имеются и другие участки, необходимые для инициации трансляции, так как на основании только первичной структуры мРНК в настоящее время невозможно предсказать эффективность сайта связывания рибосом. Более того, сайты инициации трансляции на мРНК, обладающие протяженной гомологией с 16S рРНК, функционируют плохо, возможно, из-за слишком прочного связывания рибосом с мРНК.
Существенным фактором, оказывающим влияние на уровень трансляции мРНК рибосомами, может быть вторичная структура мРНК в окрестностях инициирующего кодона [130]. Таким образом, из всего вышеизложенного следует, что структура некодирующей 5'-концевой части мРНК играет важную роль в трансляции мРНК, и, по крайней мере, эти особенности синтеза белка необходимо учитывать при конструировании векторов для экспрессии рекомбинантных генов в клетках Е. coli. Современные экспрессирующие векторы построены таким образом, что промотор, с которого начинается транскрипция клонированного гена, а также следующая за ним последовательность нуклеотидов, включающая инициирующий ATG-кодон, являются частью генов, эффективно экспрессирующихся в клетках Е. coli. Сразу
врлед за ATG-кодоном вектора располагают уникальные сайты рестрикции, по которым проводят встраивание кодирующей час-fii клонируемого гена, экспрессию которого хотят получить. В гом случае, если сайт рестрикции, по которому производится клонирование, расположен в начале кодирующей части природного гена, в результате транскрипции такой рекомбинантной молекулы образуется химерная мРНК. 5'-Концевая часть этой мРНК от промотора до сайта рестрикции для клонирования соответствует последовательности нуклеотидов вектора и кодирует несколько аминокислот природного гена, регуляторные последовательности которого использовали для конструирования экспрессирующего вектора. Протяженная же 3'-концевая часть такой мРНК будет соответствовать клонированной последовательности нуклеотидов. Если соединение этих двух частей мРНК произошло в одной рамке считывания, то в результате ее трансляции будет образовываться химерный полипептид, N-концевая часть которого кодируется вектором, а С-концевая - клонированным фрагментом ДНК. Примерами таких экспрессирующих векторов могут быть плазмиды pUC18 и pUC19 (см. рис. 6, б), продукты экспрессии которых представляют собой химерные белки, а N-концевая часть содержит N-концевые аминокислотные остатки р-галактозидазы Е. coli.
Превосходным вектором, хорошо зарекомендовавшим себя в работе, является экспрессирующий вектор pPR-TGATG-1, сконструированный в лаборатории С.В. Машко (ГосНИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов, г. Москва). Вектор функционирует по тому же самому принципу. В нем структурная часть экспрессируемого гена соединяется через уникальный сайт рестрикции Sacl с инициирующим кодоном ATG (см. рис. 12, б). В результате образуется гибридный оперон, транскрибируемый с промотора X-PR, дистальный цистрон которого представлен клонируемым геном, а цистрон, проксимальный промотору PR, содержит гибридный ген cro'-cat'-trpE, состоящий из слитных частей генов его фага X, хлорамфениколацетилтрансферазы cat и trpE Е. coli. 3'-Концевая часть цистрона содержит область реинициации трансляции, SD-последовательность гена trpD Е. coli и перекрывающиеся кодоны терминации и инициации трансляции (TGATG). В этой последовательности 3'-концевой нуклеотид G является первым нуклеотидом уникального сайта рестрикции Sacl (GAGCTC). В процессе синтеза белка, направляемого вектором, образуется короткий гибридный пептид Cro'-Cat'-TrpE длиной ~120 аминокислот. Синтез пептида высокоэффективен, поскольку все регуляторные элементы вектора оптимизированы
для его образования. Сразу же после терминации синтеза пептида происходит реинициация синтеза полипептида, кодируемого клонированным геном, на перекрывающемся с кодоном TGA ATG-кодоне. Поскольку при этом не происходит освобождения рибосом из транслирующего комплекса, стадия реинициации трансляции протекает с высокой скоростью. Промотор PR в этом векторе контролируется температурочувствительным репрессо-ром фага X clts857, поэтому экспрессия клонированного гена индуцируется повышением температуры окружающей среды до 42°С и сопровождается инактивацией репрессора.
