Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Приведенные примеры четко демонстрируют роль двух основных факторов, оказывающих влияние на уровень экспрессии чужеродных клонированных генов, находящихся в составе экспрессирующих векторов в бактериальных клетках. Этими факторами являются, во-первых, оптимальная транскрипция клонированных генов и, во-вторых, эффективная трансляция транскрибированной мРНК. В обоих случаях наилучшие результаты могут быть получены при объединении в составе вектора структурной части клонированного чужеродного гена с генетическими элементами, регулирующими транскрипцию и трансляцию (промоторы, SD-последовательности и т.п.) бактериальных клеток-хозяев или их вирусов. Знание главных принципов, лежащих в основе регуляции транскрипции и трансляции, позволяет конструировать новые регуляторные последовательности (например, промотор Taq) путем объединения известных регуляторных элементов или использования искусственно синтезированных последовательностей нуклеотидов, представляющих собой усредненные канонические регуляторные последовательности, учитывающие особенности большого числа природных регуляторных элементов. Однако этими важными факторами не исчерпывается возможность оптимизации экспрессии рекомбинантных генов в чужеродном генетическом окружении.
Среди других факторов, оказывающих влияние на эффективность трансляции, следует упомянуть частоту использования кодонов при кодировании белков в структурных частях разных генов [131]. В настоящее время установлено, что использование синонимических кодонов (кодирующих одну и ту же аминокислоту) вырожденного генетического кода не случайно и отражает количественную представленность отдельных изоакцепторных тРНК в клетках организма. С другой стороны, частота использования кодонов в разных генах одного и того же организма является эффективным фактором, регулирующим уровень экспрессии этих генов в процессе трансляции. Чем реже тот или иной ко-
де)н используется для кодирования аминокислоты в данном организме, тем с меньшей скоростью он будет транслироваться рибосомами вследствие низкой внутриклеточной концентрации тРНК, узнающей такой кодон. Так, в группе белков дрожжей с высоким уровнем экспрессии 96% аминокислот кодируются только 25 из 61 возможного кодона. Замена этих 25 предпочтительных кодонов в 5'-концевых частях генов белков с высоким уровнем экспрессии на редко встречающиеся кодоны снижает уровень синтеза как белков, так и их мРНК. Трансляция чужеродной мРНК, содержащей редко встречающиеся кодоны, сопровождается временной задержкой синтеза белка, преждевременной терминацией трансляции, сдвигом рамок считывания и ошибочным включением аминокислотных остатков. При этом отрицательный эффект редко встречающихся кодонов проявляется сильнее всего, если они локализованы в 5'-концевой части мРНК, кодирующей N-концевые аминокислотные остатки рекомбинантного белка.
Кроме того, на эффективность трансляции кодона оказывает влияние и контекст кодона, т.е. соседние, окружающие кодон последовательности нуклеотидов [132-134]. Этот феномен предпочтительного использования одних кодонов перед другими необходимо учитывать в опытах по оптимизации экспрессии чужеродного генетического материала в гетерологичном генетическом окружении, поскольку несоответствие в частотах использования кодонов у организмов разных видов может служить серьезным препятствием для получения эффективной экспрессии клонируемых генов. Снижение уровня экспрессии под влиянием подобных факторов, в частности, наблюдали при попытках экспрессии генов растений в клетках дрожжей и других гетероло-гичных системах. Таким образом, эффекты, возникающие в связи с различной частотой использования кодонов, необходимо учитывать при подборе генетических систем для эффективной экспрессии клонированных чужеродных генов. Этот фактор может оказаться одним из решающих при получении полностью синтетических генов, например генов пептидных гормонов, для использования их в биотехнологии, а также при планировании мутационных замен нуклеотидов в белковой инженерии. Для обеспечения сверхэкспрессии эукариотических рекомбинантных белков, мРНК которых содержит редкие для Е. coli кодоны, сконструированы штаммы, в которых происходит синтез недостающих изоакцепторных тРНК. Так, в штаммах Rosetta™ (Novagene) экспрессируются на отдельной плазмиде, относящейся к одной группе совместимости с векторной плазмидой, гены
тРНК, распознающих кодоны AUA, AGG, AGA, CUA, ССС и GGA. В таких штаммах происходит резкое возрастание синтеза рекомбинантных белков, для которых данный фактор является лимитирующим [52, 53].
3.6.3. Факторы, влияющие на эффективность
экспрессии рекомбинантных генов:
стабильность рекомбинантных РНК и белков
Важным фактором, определяющим уровень экспрессии рекомбинантных генов в реципиентных клетках, является стабильность кодируемых этими генами мРНК и белков. Во введении упоминалось значение таких факторов для регуляции экспрессии генов. Не менее важную роль эти феномены играют и в контроле уровня экспрессии рекомбинантных генов в искусственных генетических системах. Замены кодонов в мРНК дрожжей на синонимические приводят не только к снижению уровня трансляции измененных мРНК в клетках дрожжей, но и сопровождаются уменьшением стабильности самих мРНК [137,138]. Достаточный уровень стабильности мРНК является одним из факторов, определяющих давление отбора на использование конкретных синонимических кодонов для кодирования белков. Важную роль во внутриклеточной стабильности мРНК играют элементы ее вторичной структуры. Так, образование шпилек на 3'-конце мРНК препятствует ее деградации под действием бактериальных экзо-нуклеаз, РНКазы II и полинуклеотидфосфорилазы. Поскольку изменение первичной структуры с учетом возможной вторичной структуры без изменения функциональных свойств представляется в настоящее время сложной задачей, проблема внутриклеточной стабильности рекомбинантных РНК решается, главным образом, путем введения мутаций в гены экзо- и эндонуклеаз бактериальной клетки-хозяина. Так называемые безРНКазные штаммы Е. coli находят применение в качестве реципиентов рекомбинантных плазмид в генной инженерии. При этом решается двойная задача: с одной стороны, в таких клетках повышается стабильность транскриптов рекомбинантных генов, а с другой -пониженный внутриклеточный уровень определенных РНКаз способствует более эффективной очистке рекомбинантных белков, так как для многих препаратов ферментов даже незначительные примеси нуклеазной активности бывают нежелательны.
