Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Таблица 4
Сравнительные характеристики различных векторов для клонирования ДНК
Вектор Хозяин Структура Размер
вставки
(т.п.о.)
Плазмиды Е. coli Кольцевая 0,1-10
Хромосома Е. coli Линейная 5-25
фага X
Космиды Е. coli Кольцевая 35-45
ВАС Е. coli Кольцевая До 300
РАС Е. coli Кольцевая 100-300
YAC S. cerevisiae Линейная хромосома 100-2000
MAC Клетки животных Линейная или кольцевая 41000 (?)
чае, несмотря на наличие теломерных последовательностей, искусственные хромосомы обнаруживали в клетках в кольцевой форме в виде молекул, амплифицированных до размера 1-10 млн п.о. Кольцевые НАС могут быть получены и вообще без теломерных последовательностей при наличии в РАС-векторе последовательности альфоидной ДНК длиной в 70 т.п.о., наличие которой совершенно необходимо для функционирования сегрегируемых искусственных хромосом. Искусственные хромосомы MAC и НАС дают возможность вводить в них целые генетические локусы и получать экспрессию соответствующих генов в культивируемых клетках или трансгенных животных. Основная проблема, с которой приходится сталкиваться при использовании данных искусственных генетических систем, это неконтролируемая экспрессия рекомбинантных генов, которые часто присутствуют в таких хромосомах в большом числе копий. Технологии MAC и НАС в настоящее время находятся в самом начале своего развития, и можно надеяться, что в недалеком будущем эти векторные системы станут гораздо более совершенными. Работы в этом направлении не прекращаются, ведь основная идея, лежащая в основе данных векторов, а именно, возможно более полная функциональная имитация природных эукариотических хромосом, выглядит весьма привлекательно, и, после ее полноценной реализации, позволит генным инженерам получать полноценную экспрессию гигантских генов высших эукариотических организмов.
В заключение этого раздела приводятся сравнительные характеристики рассмотренных основных векторных систем, кото-
рые используются в настоящее время для клонирования фрагментов ДНК (табл. 4).
3.5. Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
Векторы, пригодные для клонирования ДНК в бактериях, отличающихся от Е. coli, должны обладать всеми характерными чертами, которые были отмечены выше для плазмидных векторов. От рассмотренных они отличаются главным образом тем, что содержат природные или искусственные генетические элементы, функционирующие в новых клетках-хозяевах.
3.5.1. Интегрирующие векторы грамположительной бактерии
Bacillus subtilis
В. subtilis, как и Е. coli, является излюбленным объектом генной инженерии. Это связано с тем, что В. subtilis - непатогенный микроорганизм, многие штаммы которого широко используются в микробиологической промышленности для производства биологически активных соединений и пищевых веществ. В. subtilis в отличие от Е. coli способна секретировать белки и пептиды, что облегчает их очистку и дальнейшее использование. Большинство векторов для клонирования ДНК в клетках В. subtilis создано на основе плазмид других видов бацилл, а также Staphylococcus aureus и бактерий рода Streptococcus.
Основным свойством интегрирующих векторов является их способность стабильно встраиваться в геном клетки-хозяина. Это становится возможным благодаря наличию в таких векторах последовательностей нуклеотидов, гомологичных последовательностям геномной ДНК. В результате функционирования общей системы рекомбинации происходит объединение хромосомной и плазмидной ДНК интегрирующего вектора и стабильное включение всей векторной плазмиды в хромосому. Примером интегрирующего вектора служит плазмида pFH7 В. subtilis (рис. 12, а). Векторная плазмида содержит фрагмент ДНК умеренного бактериофага SP(3 и после попадания в клетки В. subtilis, лизогенные по данному бактериофагу, эффективно интегрируется в профаг. Поскольку плазмида содержит ген устойчивости к хлорамфениколу cat, клетки приобретают этот признак. Индукция профага приводит к образованию фаговых частиц, трансдуцирующих такую плазмиду и ассоциированный с ней признак устойчивости к хлорамфениколу. Интеграция плазмиды Щ в бактериальную хромосому происходит по механизму гомологичной рекомбинации с участием гена гесЕ. Способность к интег-
Pst]
Pstl PBR322 ВатШ
pc 194
Hindlll
6
EcoRl Bg/Il/BamHl I cat \ 0
Cla
рации в бактериальную хромосому обнаруживают и другие плазмиды, содержащие фрагменты хромосомной ДНК клеток-хозя-ев, что продемонстрировано, в частности, для плазмид Е. coli и Streptococcus pneumoniae.
Бактериальные интегрирующие векторы находят широкое применение в современной генной инженерии бактерий, в частности, при конструировании стандартных штаммов-продуцентов белков, пептидов или метаболитов. Другим интересным приложением такого рода генетических систем является создание бактериальных штаммов-биорепортеров, используемых для мониторинга окружающей среды и в экотоксикологии. Хотя современные аналитические методы позволяют обнаруживать с высокой эффективностью практически любое химическое соединение, все эти методы не дают ответа на вопрос о биологической опасности таких соединений. Данный недостаток восполняют с помощью биосенсоров в формате целых бактериальных клеток, которые позволяют обнаруживать индивидуальные вещества или группы химических соединений, для которых характерно однотипное взаимодействие с биологическим материалом. Например, для обнаружения фитотоксичных химических соединений применяют генетически модифицированные цианобактерии, исходные представители которых присутствуют в большом разнообразии в фотосинтезирующей биосфере. Введение в хромосому цианобак-
