Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
4. Патрушев Л.И. Т. 1 ^7
ной среде с антибиотиком G418 или на среде HAT. При получении удачных конструкций мини-МАС, содержащие область центромеры, две теломерные последовательности и области начала репликации, не утрачиваются культивируемыми клетками на протяжении 60 генераций, даже в том случае, если клетки выращивают не в селективных условиях. Сначала MAC и НАС получали в клетках человека или соматических гибридах человек-хомячок, однако, из-за низкой частоты гомологичной рекомбинации в таких клетках в последнее время стали использовать клетки цыплят линии DT 40, предшественников В-клеток, трансформированных вирусом лейкоза, для которых характерна высокая частота кроссинго-вера. Полученные в них MAC далее переносят в клетки человека для дальнейшего изучения. С помощью данного метода было установлено, что размер Х-хромосом человека может быть уменьшен до 500 т.п.о. без потери ими способности к автономному стабильному существованию внутри клеток [113].
Получение искусственных хромосом с использованием са-теллитной ДНК (satellite DNA-based artificial chromosome -SATAC) является другим распространенным методом “сверху вниз”, основанном на использовании горячих точек нестабильности генома в амплифицируемых перицентромерных областях акроцентрических хромосом [114]. В этом случае плазмидную ДНК, содержащую селектируемый маркер, вводят с помощью гомологичной рекомбинации в перицентромерную область гетерохроматина хромосом мышей или человека. Клетки, содержащие такие хромосомы, далее культивируют на селективной среде, что сопровождается амплификацией маркерной последовательности плазмиды и окружающих перицентромерных последовательностей (подробнее о механизме такой амплификации см. раздел 5.2.1). В итоге формируется дицентрическая (содержащая две центромеры) хромосома, что сопровождается ее разрывом во время митотических делений с образованием дополнительных искусственных хромосом, размер которых может быть в пределах 10-360 млн п.о. Эти хромосомы, состоящие из последовательностей перицентромерного гетерохроматина, которые перемежаются введенной рекомбинантной ДНК, далее могут быть перенесены в клетки животных других видов и человека. Такие искусственные хромосомы правильно сегрегируют в митозе в дочерние клетки и содержат большое количество специфических повторяющихся последовательностей, что позволяет легко выделять их с помощью проточной цитометрии (раздел 2.1.2). Кроме того, показано, что такие хромосомы могут быть использованы для создания стандартными методами
трансгенных мышей, которые содержат искусственные хромосомы во всех соматических клетках [115].
Конструирование MAC методом “снизу вверх”. При этом подходе искусственную минихромосому собирают из отдельных последовательностей, соответствующих теломерам, центромерам и областям начала репликации природных хромосом, с которыми объединяют требуемую рекомбинантную ДНК. Теломерные последовательности животных представляют собой тандем-но повторяющиеся последовательности вида (TTAGGG)„, которые, будучи объединенными в повторы длиной ~1 т.п.о., эффективно функционируют в клетках человека. В качестве областей начала репликации могут быть использованы различные последовательности, среди которых наиболее изучены соответствующие последовательности (З-глобинового гена человека.
Последовательности, составляющие центромеры, исследованы в меньшей степени, и с ними сложнее работать генно-инженерными методами. Основным компонентом центромер человека является а-сателлитная (алъфоидная) ДНК, которая сформирована семейством повторяющихся последовательностей, специфичных для центромер приматов. Альфоидные мономеры (-170 п.о.) в центромерах человека в свою очередь составляют протяженные последовательности длиной в несколько млн п.о., организованные в повторы более высокого порядка (higher order repeats - HOR). Гомология между мономерами альфоидной ДНК отдельных хромосом составляет 60-80%, тогда как организация тандемно повторяющихся HOR близка к идентичной. С учетом структуры альфоид-ных мономеров и HOR хромосомы человека разделяют на несколько семейств [116]. Кроме обычных центромер, построенных на основе альфоидной ДНК, в маркерных хромосомах человека, иначе называемых также небольшими добавочными хромосомами (small accessory chromosomes - SACs), обнаружены неоцентромеры, не содержащие а-сателлитной ДНК. Неоцентромеры также используются при конструировании MAC методом “снизу вверх”.
Котрансфекция (липофекция) культивируемых клеток человека смесью синтетической альфоидной ДНК, теломерных последовательностей, геномной ДНК человека и маркерного гена сопровождается образованием нескольких минихромосом, как следствие укорачивания эндогенных хромосом клетки. Кроме того, в таких клетках имело место образование искусственных минихромосом de novo. Более эффективным способом создания MAC и НАС является их генно-инженерное конструирование на основе стандартных векторов YAC, ВАС и РАС путем введения в них альфоидной ДНК и теломерных последовательностей. В этом слу-
