Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
5'-концевой блок трансляции (5'-translational blockage). Введение редко используемых кодонов в мРНК вблизи сайта инициации трансляции часто сопровождается подавлением трансляции мРНК гена-репортера. Ингибирования не происходит, если тот же самый кодон расположить ниже в рамке считывания. Данный Эффект является следствием первичной структуры мРНК, а не особенностей ее пространственной структуры, которая могла бы формироваться при участии этого кодона, и связан с недостатком соответствующей тРНК.
Все эти и еще многие другие особенности регуляции трансляции необходимо учитывать при конструировании искусственных генетических систем экспрессии исследуемых генов [142, 143].
Влияние терминатора транскрипции вектора. Наличие действенного терминатора транскрипции позади экспрессируемого рекомбинантного гена является еще одним условием эффективной экспрессии рекомбинантного белка. В том случае, если РНК-по-лимераза не прекращает синтеза РНК на границе рекомбинантного гена, может образоваться полицистронный транскрипт, в котором сайты инициации трансляции векторной плазмиды будут конкурировать за соответствующие участки целевой рекомбинантной мРНК. В частности, этот эффект может иметь место при включении в полицистронную мРНК последовательности гена Ыа, определяющего устойчивость клеток к ампициллину.
Все эти и еще многие другие особенности регуляции трансляции необходимо учитывать при конструировании искусственных генетических систем экспрессии исследуемых генов [142, 143].
3.6.5. Особенности биосинтеза эукариотических рекомбинантных
белков в бактериальных клетках: тельца включения
Экспрессия эукариотических генов в бактериальных клетках связана еще с одной проблемой: большая часть рекомбинантных эукариотических белков, а также некоторые прокариотические белки при очень высоком уровне биосинтеза переходят в нерастворимое состояние, образуя в клетках так называемые тельца
включения. Последние представляют собой частицы, состоящие главным образом из агрегатов рекомбинантного белка и ряда бактериальных белков. Рекомбинантные белки в тельцах включения находятся, как правило, в денатурированном неактивном состоянии, и для их получения в растворимом виде приходится применять мощные денатурирующие агенты, такие как мочевина, гуанидинх-лорид и детергенты [144-146]. Солюбилизированный в этих жестких условиях рекомбинантный белок для восстановления нативной конформации требует ренатурации, в процессе обработки денатурирующими агентами белки могут изменять свою структуру, а при концентрировании из разбавленных растворов, в которых проводится ренатурация, часто вновь выпадают в осадок.
В чем же причина такого аномального поведения рекомбинантных эукариотических белков в бактериальных клетках? Для поддержания белков в растворимом состоянии в клетках эукариот реализуются три основных механизма: компартментализация продуктов трансляции, белок-белковые взаимодействия и пост-трансляционные модификации. Образующиеся в эндоплазмати-ческом ретикулуме полипептидные цепи не распределяются хаотически в цитоплазме эукариотических клеток, но последовательно переходят через ряд компартментов, где претерпевают посттрансляционные модификации. При этом внутренние условия отдельных компартментов могут существенно различаться. Так, молекулы инсулина накапливаются in vivo в секреторных гранулах, pH в которых составляет 4,5-5,5, в то время как pH цитоплазмы бактериальных клеток приближается к 7,8. В этих условиях инсулин лишь слабо растворим. Многие гидрофобные эукариотические белки не существуют в растворимой форме в отсутствие фосфолипидов мембран. Белки молока являются интегральной частью мицелл, стабилизированных ионами Са2+.
Посттрансляционные модификации белков, в частности, фо-сфорилирование, гидроксилирование, гликозилирование и ограниченный протеолиз, происходящие в определенных компарт-ментах эукариотических клеток, также оказывают большое влияние на растворимость белков, их стабильность и биологические функции. Это особенно относится к секретируемым белкам эукариот. Поскольку в бактериальных клетках соответствующие системы посттрансляционных модификаций белков отсутствуют, в них не могут быть получены биологически полноценные рекомбинантные эукариотические полипептиды, что накладывает ограничения на использование бактерий в биотехнологии.
Наконец, третьим ключевым фактором, оказывающим влияние на растворимость белков, является их нативная конформация
g растворе. Правильное сворачивание (фолдинг) полипептидных $^епей некоторых белков в клетках эукариот обеспечивается специфическими белками, называемыми шаперонами, которые необходимы для эффективного формирования третичной структуры полипептидных цепей других белков, но не входят в состав конечной белковой структуры. Шапероны оказывают влияние лишь pa конформацию полипептидных цепей и не действуют на ковалентные связи белковых молекул. К этому классу полипептидов относятся цитозольные белки теплового шока Hsp70 и Hsp60, а также гомологичные им белки, например белок, связывающийся е тяжелой цепью иммуноглобулинов (BiP). Шапероном является также ядерный нуклеоплазмин, обеспечивающий сборку нуклео-сом. У Е. coli соответствующие функции выполняют белки SecB, триггерный фактор, а также GroEL и GroES, обеспечивающие экспорт полипептидов из цитоплазмы и участвующие в морфогенезе бактериофагов. Два последних белка - GroEL и GroES, известные также как СрпбО и СрпЮ, кодируются генами оперона groE, регулируемого тепловым шоком. Белки, эволюционно родственные белку GroEL, получили название шаперонинов.
