Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
терии Synechocystis РСС 6803 гена люциферазы светлячков (1ис) под контролем tac-промотора превращает его в стабильного продуцента этого фермента. Функционирование люциферазы, в свою очередь, зависит от концентрации АТР в клетках (см. раздел II.3.2.2), которая отражает их метаболическую активность. По подавлению биолюминесценции судят о токсическом действии веществ на метаболизм этой бактерии.
Интегрирующие векторные системы, в которых используется тот же принцип гомологичной рекомбинации, разработаны и для эукариотических клеток, включая клетки животных и растений. В конце концов, такие работы привели к развитию целого направления исследований по созданию трансгенных животных и растений, стабильно наследующих и экспрессирующих гены, искусственно введенные в их геном.
Наличие гомологичной рекомбинации между хромосомной ДНК клетки-хозяина и векторной ДНК, содержащей гомологичные хромосомной ДНК последовательности нуклеотидов, приходится учитывать при получении соответствующих генно-инженерных конструкций. Такая неконтролируемая рекомбинация в большинстве случаев нежелательна, так как может приводить к потере или структурным перестройкам клонированных фрагментов ДНК. Для того, чтобы свести последствия этого явления к минимуму, используют специальные штаммы клеток-хозяев, в которых общая система рекомбинации не функционирует, например, вследствие мутационной инактивации гена recA Е. coli или гесЕ В. subtilis.
3.5.2. Челночные векторы
Интегрирующая плазмида pFH7 (рис. 12, а) дает возможность проиллюстрировать еще один важный принцип, широко используемый при конструировании векторных систем в генной инженерии. Эта плазмида получена путем объединения двух репликонов, один из которых берет начало от плазмиды рС194 В. subtilis, а другой - от плазмиды pBR322 Е. coli, что дает возможность вектору существовать и стабильно реплицироваться как в клетках Е. coli, так и В. subtilis. Такие векторы, способные реплицироваться в клетках-хозяевах разных биологических видов, называют челночными, или бинарными векторами.
Принципы конструирования и функционирования челночных векторов одинаковы, они должны включать в себя репликоны тех генетических систем, в которых будет происходить репликация челночного вектора. При этом используются области начала репликации генетических элементов, которые автономно суще-
ствуют во внехромосомном состоянии в природных условиях. Так, интегрирующий вектор pFH7 В. subtilis обладает свойствами челночного вектора, поскольку для его конструирования применены репликоны двух видов бактерий. Более эффектными примерами челночных векторов являются плазмидные ДНК, способные реплицироваться в клетках высших (животных и растений) и низших организмов. Необходимость использования челночных векторов в генной инженерии связана с тем, что наработку в препаративном количестве векторной ДНК для проведения генно-инженерных манипуляций удобнее проводить в бактериальных клетках, тогда как получение биологически активных продуктов клонированных генов высших организмов во многих случаях возможно только в клетках своего или близкого вида, в которых эти гены экспрессируются в природных условиях, т.е. в своем обычном генетическом окружении (подробнее см. раздел 5.2).
3.6. Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
Интенсивные исследования последних лет принесли и продолжают приносить новые знания о механизмах, обеспечивающих высокоэффективную и высокоспецифическую экспрессию генов [15]. Эту информацию успешно используют для эффективной экспрессии рекомбинантных генов в гомологичном или гете-рологичном генетическом окружении [117]. После рассмотрения основных принципов конструирования векторов для клонирования ДНК можно перейти к обсуждению проблемы экспрессии клонированных генов в искусственных генетических системах. Именно экспрессия клонированных генов является одной из основных задач генной инженерии и биотехнологии. Действительно, функциональную роль отдельных генов и их частей в живом организме можно понять и оценить лишь на основании экспрессии этих последовательностей, т.е. по фенотипическому проявлению их потенциальных биологических возможностей. Кроме того, крупномасштабная наработка биотехнологических продуктов требует осуществления эффективной экспрессии конкретных генов в искусственно созданных условиях. Для получения полноценной экспрессии клонированных генов используют экспрессирующие векторные системы, принципы конструирования которых в настоящее время хорошо разработаны.
Напомним, что экспрессия генетической информации, заключенной в генах живых организмов, в соответствии с основным по-
ДНК -«------------Число копий генов
Транскрипция -ч----------Активность промоторов
РНК **-------------Стабильность мРНК
Трансляция
Белок Фолдинг
Посттрансляционные
модификации
