Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Патрушев Л.И. -> "Искусственные генетические системы. Том 1" -> 38

Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.

Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Том 1 — М.: Наука, 2004. — 256 c.
Скачать (прямая ссылка): iskusstvenniegeneticheskie2004.djvu
Предыдущая << 1 .. 32 33 34 35 36 37 < 38 > 39 40 41 42 43 44 .. 221 >> Следующая

Упаковка ДНК в головки бактериофага Р1, как и ДНК фага X, Происходит по заполняющему (headful) механизму (см. раздел 3.3). Процесс инициируется комплексом фаговых белков, получившим Название наказы (pacase), который специфически расщепляет йредшественник ДНК по рас-сайту (аналогу уже обсуждавшегося ^05-сайта бактериофага ^), состоящий из восьми гексануклеотид-^bix повторов 5'-TGATCA(G), симметрично расположенных отно-
сительно точки разрыва ДНК. Начиная с этого конца, ДНК поступает в предшественник головки, после заполнения которого ДНК разрезается второй раз (headful cleavage), что приводит к отделению упакованной ДНК от ее внешней части. Второй разрыв вносится независимо от последовательности нуклеотидов гидролизуемого участка, поэтому, в отличие от ДНК фага X, последовательности двух концов упакованной хромосомы Р1 не идентичны.
Клонирование последовательностей ДНК проводят по уникальным сайтам рестрикции полилинкера (pcs). Если размер клонированной ДНК соответствует емкости головки бактериофага, внутрь головки попадают обе последовательности сайт-специфической. рекомбинации 1охР, что позволяет рекомбинантным молекулам после перехода в бактериальные клетки из фаговых частиц замыкаться в кольцо и реплицироваться по одному из вышеупомянутых механизмов. Превышение лигированной вставкой допустимого размера приводит в процессе упаковки ДНК в фаговые частицы к удалению одного из 1охР-сайтов, что делает невозможным образование внутриклеточных кольцевых молекул, и они утрачиваются.
Дальнейшее развитие векторных РАС-систем привело к созданию семейства векторов нового поколения, pCYPAC с полилинкером, внедренным в ген sacBII, кодирующий токсичный для клеток фермент, который участвует в метаболизме сахарозы (рис. 11,6, справа) [108]. Это позволяет проводить позитивный отбор клеток, содержащих вектор со вставкой, поскольку только такие клетки выживают в селективных условиях. Вектор не требует упаковки в фаговые частицы и вводится в бактериальные клетки с помощью электропорации, содержит те же два уже рассмотренных реплико-на, один loxP-сат, а также репликон плазмиды pUC19, разрывающий ген sacBII. Это понижает токсичность гена во время наработки самого вектора в препаративном количестве, а при клонировании исследуемых фрагментов ДНК репликон удаляется. Дополнительный отбор векторных молекул осуществляют с использованием гена устойчивости к канамицину. Вставки рекомбинантной ДНК в таких векторных системах стабильны, и образование химерных молекул, которые являются бичом векторных YAC-систем, не отмечено, что делает весьма удобным использование РАС-векто-ров для конструирования геномных клонотек крупных геномов животных и растений с последующим их анализом.
3.4.2. Искусственные хромосомы животных и человека
Использование высокоемких векторов YAC, ВАС и РАС оказало и продолжает оказывать неоценимую пользу при реализа-
ции крупных научных проектов по секвенированию больших геномов, включая геном человека. Тем не менее все вышеперечисленные векторные системы не удовлетворяют полностью запросов современной молекулярной генетики, особенно в областях получения трансгенных животных и генотерапии. Для осуществления экспрессии генов в трансгенных организмах в настоящее время чаще всего применяют кДНК и искусственные промоторы, что исключает осуществление полноценного контроля транскрипции рекомбинантных генов. В этой связи возникает необходимость введения в клетки протяженных геномных последовательностей с полноценной интрон-экзонной структурой и собственными регуляторными участками, а также целых областей хромосом высших организмов. Осуществлять такие генно-инже-нерные манипуляции позволяют искусственные хромосомы животных (mammalian artificial chromosomes - MAC) и одна из их разновидностей - искусственные хромосомы человека (human artificial chromosome - НАС), которые, благодаря собственной системе, обеспечивающей правильную сегрегацию в митозе, дают возможность не прибегать к введению рекомбинантных молекул в геном модифицируемых клеток, а следовательно, избегать нежелательных последствий его модификации, сопровождаемой эффектами положения, инсерционным мутагенезом и тому подобными неприятными явлениями. При конструировании MAC и НАС, в основном, используют две стратегии [109-112].
Конструирование MAC методом “сверху вниз”. Данная стратегия основана на последовательном укорачивании природных хромосом с сохранением их элементов, обеспечивающих репликацию и митотическую сегрегацию. Эта группа методов известна как фрагментация хромосом с использованием теломерных последовательностей (telomere-associated chromosome fragmentation - TACF) или укорачивание с помощью теломер (telomere directed truncation - TDT). Метод основан на гомологичной рекомбинации между вектором (YAC) и укорачиваемой хромосомой, в результате которой происходит замена большей части последовательностей плеч хромосомы на последовательности вектора. Такой вектор исходно содержит последовательности, гомологичные таковым изменяемой хромосомы, по которым происходит крос-синговер, селектируемый маркер (обычно ген устойчивости к антибиотику пео или gpt, кодирующий гуанинфосфорибозилтранс-феразу) и теломерные последовательности. Гомологичную рекомбинацию при модификации хромосом человека проводят по последовательностям альфоидной ДНК центромер или уникальным последовательностям, отбирая рекомбинантов на селектив-
Предыдущая << 1 .. 32 33 34 35 36 37 < 38 > 39 40 41 42 43 44 .. 221 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed