Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Патрушев Л.И. -> "Искусственные генетические системы. Том 1" -> 47

Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.

Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Том 1 — М.: Наука, 2004. — 256 c.
Скачать (прямая ссылка): iskusstvenniegeneticheskie2004.djvu
Предыдущая << 1 .. 41 42 43 44 45 46 < 47 > 48 49 50 51 52 53 .. 221 >> Следующая

Правило N-концевой последовательности (N-end rule). На стабильность рекомбинантного белка оказывает заметное влияние природа аминокислотного остатка, непосредственно следую-
|цего за инициаторным N-концевым метионином. Этот аминокислотный остаток определяет эффективность удаления остатка формилметионина (fMet), с которого всегда начинается синтез цолипептидных цепей в бактериях. Такой N-концевой процессинг полипептида осуществляется метиониламинопептидазой, которая удаляет fMet, и с увеличением размера аминокислотного остатка, непосредственно следующего за fMet, уменьшается эффективность этого процесса [139]. Резкое снижение или полное прекращение процессинга имеет место в том случае, если в этом положении полипептидной цепи находятся остатки His, Gin, Glu, phe, Met, Lys, Tyr, Trp или Arg. При наличии в этом положении любого из оставшихся аминокислотных остатков от 16% до 97% полипептидов подвергаются процессингу.
Зависимость между природой N-концевых остатков в белках и их стабильностью в бактериальных клетках определяется правилом N-концевой последовательности [140]. В том случае, если на N-конце полипептида после удаления fMet оказываются Arg, Lys, Phe, Leu, Trp и Туг, время полужизни белка составляет < 2 мин, и оно становится >10 мин при наличии в этом положении всех остальных аминокислотных остатков. Соответствующие аминокислотные остатки являются сигналом для распознавания белков убиквитин-зависимой системой протеолиза.
Проблема внутриклеточной стабильности рекомбинантных белков больше связана с деградацией небольших пептидов, поскольку крупные нативные белки более стабильны в бактериальных клетках. Один из подходов, позволяющих стабилизировать короткие чужеродные пептиды в клетках Е. coli, - включение требуемого пептида в состав гибридного белка. В этом случае последовательность нуклеотидов, кодирующую гибридный белок, соединяют в составе экспрессирующего вектора в одной рамке считывания с бактериальным геном, кодирующим белок (например, геном р-галактозидазы). Образующийся в результате экспрессии такого рекомбинантного гена гибридный белок в своем составе содержит в N- или С-концевой части требуемый пептид, защищенный основным белком-носителем от протеолитической деградации. Для отделения пептида от белка-носителя их соединяют друг с другом последовательностью аминокислот, по которой можно провести специфическое расщепление полипептидной цепи. В том случае, если пептиды не содержат метионина, соединение белка-носителя и пептида осуществляют через эту аминокислоту, и отщепление пептида производят с помощью бромистого циана. Такой подход был использован, например для получения рекомбинантного соматостатина, а также А- и В-цепей инсулина.
Для разделения рекомбинантного пептида и белка-носителя можно использовать и протеолитические ферменты. Для этого требуемый пептид соединяют с белком-носителем с помощью последовательности аминокислот, специфически расщепляемой протеолитическим ферментом, например пептидазой клостридий (клострипаином) в случае получения кальцитонина или трипсином для получения р-эндорфина.
Второй подход, позволяющий защищать рекомбинантные белки от внутриклеточного протеолиза, - выведение их в пери-плазматическое пространство или окружающую среду после завершения биосинтеза. При таком подходе рекомбинантные полипептиды соединяют с сигнальными последовательностями аминокислот белков (р-лактамаза, OmpA, OmpF, PhoA), секретируе-мых во внешнюю среду и периплазматическое пространство. Подобным путем были получены, например проинсулин, гормон роста человека и р-эндорфин.
3.6.4. Другие причины низкой эффективности
экспрессии рекомбинантных генов в бактериях
Вторичные сайты инициации трансляции. Иногда в результате экспрессии рекомбинантного гена в бактериальных клетках образуется укороченная форма рекомбинантного белка, что связывают обычно с протеолитической деградацией исходной поли-пептидной цепи. Однако наличие сайта вторичной инициации трансляции в мРНК также может быть причиной этого явления [141]. Последовательность внутри мРНК, напоминающая сайт связывания рибосом AAGGAGG, которая расположена за 5-13 нуклеотидов перед AUG-кодоном, может стать причиной такой ошибочной инициации синтеза белка.
Вторичная структура транскрипта рекомбинантного гена. Неблагоприятная вторичная структура гибридных рекомбинантных генов, особенно в окрестностях сайта инициации трансляции, также может приводить к неэффективной трансляции соответствующих мРНК [130]. Поэтому компьютерный поиск последовательностей, комплементарных последовательностям, находящимся вблизи сайта связывания рибосом транслируемой мРНК с последующим дизайном рекомбинантного гена может решить эту проблему. В ходе дизайна самокомплементарность внутри мРНК можно преодолеть путем введения синонимических замен нуклеотидов, которые не изменяя смысла кодонов окажут влияние на образование неблагоприятной вторичной структуры мРНК.
Неожиданное возникновение кодонов терминации трансляции. Возникновение при экспрессии укороченного, легко дегра-|ируемого рекомбинантного белка может быть следствием появления в результате мутации в кодирующей части рекомбинантного гена нового терминирующего кодона. Наличие такого артефакта обычно обнаруживается при секвенировании гена или его экспрессии в бесклеточных системах трансляции, сопряженной с Транскрипцией.
Предыдущая << 1 .. 41 42 43 44 45 46 < 47 > 48 49 50 51 52 53 .. 221 >> Следующая
Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed