Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
_________Сайты связывания
рибосом
---------Использование кодонов
---------Стабильность белков
Многие факторы,
определяемые
клеткой-хозяином
б
Биологическая
активность
Рис. 13. Основные факторы, оказывающие влияние на эффективность передачи генетической информации на разных этапах экспрессии рекомбинантных генов в бактериальных клетках
а - ключевые этапы экспрессии генов. Справа указаны факторы, оказывающие наибольшее влияние на уровень биосинтеза рекомбинантных белков in vivo;
б - основные регуляторные участки нуклеиновых кислот, контролирующее транскрипцию и трансляцию
стулатом молекулярной биологии осуществляется путем ее переноса от нуклеиновых кислот к белкам по схеме: ДНК РНК —> белок, и эффективность прохождения любого из этих, а также некоторых промежуточных этапов влияет на общий выход зрелого белкового продукта (рис. 13). Полноценный в функциональном отношении ген, в том числе и рекомбинантный, состоит из двух основных частей - регуляторной и структурной (рис. 13, б). Генетический код, с помощью которого последовательность нуклеотидов в кодирующей структурной части гена определяет последовательность аминокислот в кодируемом этим геном белке, за немногими исключениями, универсален для всех живых организмов. Это дает принципиальную возможность получения полноценной экспрессии самых разнообразных осмысленных последовательностей нуклеотидов, в том числе и искусственно синтезированных, в любом природном генетическом окружении. Таким образом, универсальность генетического кода является основой для создания функционально активных генно-инженерных конструкций.
Регуляторные части генов, а также продукты их экспрессии, мРНК и белки, распознаются соответствующими ферментными системами организма и обеспечивают упорядоченную экспрессию структурной части гена. При этом регуляторные участки генов и промежуточных продуктов их экспрессии, как правило, высокоспецифичны в отношении своих природных генетических эффекторов (РНК-полимераз, рибосом, факторов транскрипции и трансляции, белковых факторов сплайсинга, ферментов, осуществляющих посттрансляционные модификации полипептидов, и т.п.), и чаще всего они не могут эффективно функционировать в гетерологичном генетическом окружении. Очевидно, что при конструировании высокоэффективных экспрессирующих векторов необходимо, прежде всего, учитывать особенности структуры регуляторной части рекомбинантного гена, исходя из того, в каких генетических условиях клонированный ген будет экспрессироваться. Однако не только регуляторные последовательности генов являются препятствием для высокоэффективной экспрессии чужеродных рекомбинантных генов. Как уже было отмечено, структурные части генов про- и эукариот фундаментально отличаются друг от друга по наличию у последних внутри генов нитронов. Следовательно, гены эукариот не могут эффективно экспрессироваться в бактериальных клетках, поскольку у прокариот отсутствуют соответствующие системы сплайсинга. Кроме того, у предшественников эукариотических мРНК не может осуществиться в бактериальных клетках и правильный процессинг 3'- и 5'-концевых некодирующих последовательностей. Даже такой
беглый взгляд на проблему экспрессии рекомбинантных генов в чужеродном генетическом окружении позволяет увидеть многочисленные препятствия, лежащие на пути решения этой проблемы. Ниже будут рассмотрены факторы, которые необходимо учитывать при конструировании экспрессирующих векторов.
3.6.1. Факторы, оказывающие влияние на эффективность экспрессии рекомбинантных генов в бактериальных клетках: транскрипция
Для экспрессии клонированного гена в клетках Е. coli или любого другого организма необходимо, чтобы этот ген был транскрибирован РНК-полимеразой, а образовавшаяся РНК транслирована рибосомами с образованием нативного белкового продукта. Таким образом, для эффективной экспрессии в клетках Е. coli любой ген должен находиться под контролем регуляторных элементов данного микроорганизма, основным из которых является промотор [118].
Базальный уровень транскрипции рекомбинантных генов обеспечивается небольшим набором упорядоченных регуляторных последовательностей. Например, у Е. coli это происходит при наличии перед структурной частью клонированного гена последовательностей в окрестностях нуклеотидов +1, -10 и -35 (где нуклеотид в положении +1 указывает на точку инициации транскрипции).
-35 -10 +1
...TTGACA ...... ТАТААТ ........ cat - консенсус
...ТТГАСА ...... ТАТА7Т ........ cat -/ас-промотор
...TTGACA ...... ТТААСТ ........ cat - Ггр-промотор
...TTGACA ...... GATACT ........ cat - Р^-промотор фага X
В представленных последовательностях промоторов Е. coli, наиболее часто используемых в генно-инженерных конструкциях для экспрессии в этих клетках, отмечены различия (выделены курсивом), которые оказывают влияние на эффективность использования промотора РНК-полимеразой (“силу” промотора). В конечном счете, сила промотора определяется легкостью образования так называемого открытого комплекса между РНК-по-лимеразой и промотором, в котором происходит стабильное локальное расплетение цепей ДНК, что необходимо для инициации транскрипции. Естественно, легкость такой ферментативной денатурации ДНК зависит от первичной структуры окружающих этот участок последовательностей нуклеотидов. Консенсусная последо-
