Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Из других белков, участвующих в сворачивании полипептидных цепей, следует упомянуть т.н. фолдазы и изомеразы. Наиболее хорошо изученными ферментами этой группы являются тио-редоксин и глутаредоксин, которые наряду с глутатионзависи-мым превращением рибонуклеотидов в дезоксирибонуклеотиды способны восстанавливать дисульфидные связи в белках, способствуя формированию у них правильной третичной структуры. Те же функции выполняет и дисульфидизомераза белков, осуществляя образование дисульфидных связей в секретируемых белках после их переноса через мембраны эукариотических клеток. Лимитирующей стадией в образовании правильной третичной структуры полипептидных цепей является цис-транс-изомеризация остатков пролина в полипептидных цепях. Этот процесс в клетках эукариот осуществляется с участием иролш-цис-транс-изомеразы. Поскольку все вышеперечисленные условия, необходимые для поддержания эукариотических рекомбинантных белков в растворимой форме, не могут быть реализованы в бактериальных клетках, в них происходит агрегация рекомбинантных белков с образованием телец включения. В настоящее время не существует универсального метода, который бы позволял получать рекомбинантные эукариотические белки в бактериальных Клетках в нативном виде. В некоторых случаях понижение температуры выращивания рекомбинантных бактерий до 30 °С приводит к образованию полностью растворимых рекомбинантных
белков [147]. Это наблюдали в случае рекомбинантного у-интер-ферона, A-цепи рицина, щелочного фактора роста фибробластов и в ряде других случаев.
Более универсальным подходом к получению рекомбинантных белков в растворимой форме является обеспечение секрети-руемого характера их экспрессии, т.е. секреции синтезирующихся рекомбинантных белков в питательную среду [148]. Системы секреции у грамположительных и грамотрицательных бактерий интенсивно изучаются. Получение рекомбинантных эукариотических белков в секретируемой форме высокотехнологично, поскольку значительно облегчает их очистку. Кроме того, у секре-тируемых белков больше шансов приобрести нативную конформацию, так как сворачивание полипептидных цепей происходит в большом объеме, а следовательно, и более низкой их концентрации, что предотвращает агрегацию полипептидных цепей, не полностью сформировавших свою третичную структуру. Примером эффективного использования секреторной системы Е. coli является получение рекомбинантного инсулиноподобного фактора роста I (IGF-I) в секретируемой форме [149]. В этой системе удавалось нарабатывать до 1 г рекомбинантного белка в 1 л бактериальной культуры. Секретируемая система экспрессии на основе грамотрицательной бактерии Pseudomonas aeruginosa будет кратко рассмотрена ниже в разделе 5.1.1.
Еще одним возможным, хотя и более труднореализуемым подходом к эффективному синтезу растворимых рекомбинантных белков в бактериальных клетках является введение экспрессирующихся генов шаперонов в клетки бактерий-хозяев [150, 151]. Так, сверхэкспрессия гомологичного gro-оперона в клетках Е. coli, содержащих экспрессирующиеся гены большой и малой субъединиц Rubisco цианобактерии Anacistis nidulans, приводила к 5-10-кратному возрастанию внутриклеточного содержания нативного рекомбинантного белка Rubisco. В некоторых случаях внутриклеточную агрегацию белков сверхэкспрессирующихся генов удается предотвратить искусственной заменой отдельных аминокислот в полипептидных цепях методами белковой инженерии. Например, удаление семи аминокислот перед спиралью G в N-концевой части полипептидной цепи фрагмента Клёнова ДНК-полимеразы IЕ. coli, а также замена нескольких гидрофобных аминокислот, боковые цепи которых экспонированы на поверхности спирали G, на остатки аспарагина полностью предотвращали внутриклеточную агрегацию фрагмента и образование агрегатов в процессе его очистки. В нативной молекуле ДНК-полимеразы I участок полипептидной цепи, в котором проведены
замены, закрыт доменом 5' —> З'-экзонуклеазы, отсутствующим у фрагмента Клёнова, и не оказывает влияния на агрегационные свойства фермента.
Правильный выбор вектора и штамма-хозяина помогает решать вышеперечисленные проблемы, связанные с низкой эффективностью экспрессии рекомбинантных белков в гетерологичных системах. С помощью современных векторов можно повысить растворимость и эффективность фолдинга рекомбинантных белков, по крайней мере, тремя путями. Во-первых, экспрессировать рекомбинантный белок в составе гибридного полипептида, другой компонент которого сам по себе обладает высокой растворимостью. Это относится, например, к глютатион-Б-трансферазе, тиоредоксину, бактериальному белку NusA [152,153]. Во-вторых, обеспечить слияние рекомбинантного белка с ферментом, участвующим в образовании дисульфидных связей, например, тиоре-доксином, или белками DsbA и DsbC. В-третьих, снабдить рекомбинантный белок сигнальной последовательностью, которая бы обеспечивала его экспорт в периплазматическое пространство.
Фолдинг рекомбинантных белков в цитоплазме может быть улучшен при использовании для их экспрессии бактериальных штаммов, содержащих мутации в генах тиоредоксинредуктазы trxB и глютатионредуктазы gor [154]. Это связано с тем, что у Е. coli образование дисульфидных связей в белках происходит преимущественно во время их экспорта в периплазматическое пространство, поскольку цитоплазма обладает высоким восстанавливающим потенциалом [155]. У двойных мутантов по этим генам имеет место, по крайней мере, 10-кратное повышение уровня образования нативных белков, для которых существенным является правильное формирование дисульфидных связей. Многие вышеупомянутые векторы и бактериальные штаммы в настоящее время можно приобрести у некоторых фирм, например, на фирме Novagene (США).
