Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
1 М раствор NaOH. Способы нанесения препаратов на гель остаются теми же, что и для ИЭФ в пластинах ПААГ.
При ИЭФ в геле агарозы размером 11X12,5 см и толщиной
2 мм с использованием прибора Мультифор и температурой охлаждающей жидкости 10° рекомендуется мощность тока ограничить уровнем 6,25 Вт. Это примерно вдвое меньше, чем рекомендовано выше для пластины ПААГ, с учетом соотношения их площадей. Здесь сказывается заметно меньшее, чем у ПААГ, сопротивление геля агарозы миграции белков. Для белков среднего размера процесс ИЭФ при такой мощности тока длится около часа. При первом фракционировании белков неизвестной подвижности продолжительность разделения целесообразно увеличить для выяснения времени, необходимого для достижения равновесного состояния. Измерения pH вдоль градиента производят торцевым электродом, как описано выше.
Операции окрашивания и отмывки гелей агарозы отличаются некоторым своеобразием, связанным с тем, что для их ускорения пластину агарозы целесообразно предварительно сжатьр высушить. Процедуру начинают с осаждения белков и вымывания амфолитов, для чего пластину помещают на 5 мин в водный раствор, содержащий 10,5% ТХУ и 3,5% сульфосалициловой кислоты. Уменьшение продолжительности этой обработки по сравнению с пластинами ПААГ оправдано значительно большей пористостью 1%-ного геля агарозы. Затем пластину промывают двумя сменами 96%-ного этанола (по 10 мин в каждой) и покрывают смоченным в этаноле листком фильтровальной бумаги. На него кладут еще 4—5 листков сухой фильтровальной бумаги, накрывают стеклянной пластинкой и прижимают ее грузом примерно в 1 кг. За 20 мин пластина геля заметно сжимается. Сняв груз и бумагу, гель агарозы подсушивают феном до состояния тонкой пленки. Эту пленку окрашивают в течение 10 мин 0,11%-ным раствором СВВ R-250 в смеси, содержащей 8% уксусной кислоты и 25% этанола, без подогрева, затем отмывают в трех сменах того же растворителя (по 10 мин) и снова высушивают. Закрепленная на прочной и гибкой пластмассовой подложке тонкая пленка окрашенного геля агарозы удобна для хранения и фотографирования. Из нее можно вырезать представляющие интерес треки сфокусированных белков. Если при ИЭФ использовали гель агарозы без подложки, то ее можно ввести при высушивании, уложив на нее гель перед началом
его сжатия. Для этой цели удобно использовать освобожденную от эмульсии рентгеновскую пленку.
Отметим еще одно преимущество использования агарозы для ИЭФ в пластинах. Благодаря крупнопористости гелей агарозы и, следовательно, легкости выхода из них белков для их идентификации можно использовать иммунофиксацию. Для этого на влажный гель агарозы после окончания ИЭФ накладыва* ют на 12 ч лист фильтровальной бумаги, пропитанной антисывороткой. Выходящие из агарозы в бумагу антигены образуют в ней иммунопреципитаты, которые можно обнаружить одним из методов, подробно описанных в следующей части книги. С помощью такого приема недавно была продемонстрирована микрогетерогенность тироксин-связывающих глобулинов сыворотки человека [Burnet,t et al., 1980].
Глава 3
ДВУМЕРНОЕ ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ БЕЛКОВ
МЕТОД О'ФАРРЕЛЛА
В 1975 г. О’Фаррелл опубликовал сенсационные результаты двумерного фракционирования радиоактивно меченных суммарных белков Е. coll. В первом направлении он использовал ИЭФ, а во втором — ступенчатый электрофорез в присутствии ДДС-Na с использованием градиента концентрации ПААГ. По окончании фракционирования на пластине методом авторадиографии было выявлено около 1100 пятен различных белков (рис. 14). Метод О’Фаррелла получил очень широкое распространение. Разумеется, за 5 лет он претерпел ряд дальнейших модификаций, которые будут рассмотрены ниже, но сначала отметим характерные особенности оригинального метода, избегая деталей, подробно описанных автором в его первой работе [O’Farrell, 1975].
ИЭФ в первом направлении проводили в трубках длиной 13 см с внутренним диаметром 2,5 мм. 4%-ный ПААГ (С—2,6) полимеризовали в 9,5 М растворе мочевины с добавлением 2% неионного детергента NP-40 (Nonidet Р-40). Амфолины («LKB») в этот раствор вносили до суммарной концентрации 2% (масса/объем), причем 1,6% составляли амфолины диапазона pH 5—7 и 0,4%—pH 3—10. Инициаторные добавки вводили в относительно малых количествах: 0,01% персульфата аммония и 0,07% ТЕМЭД. Полимеризация геля занимала 2—4 ч. При этом сначала на гель наслаивали 8 М раствор мочевины, затем его заменяли указанной выше смесью 9,5 М. мочевины и 2% NP-40 с добавлением 5% р-меркаптоэтанола.
Перед установкой трубок в прибор для вертикального электрофореза их нижние торцы приходилось закрывать диализной
Рис. 14. Распределение пятен радиоактивности при двумерном фракционировании белков Е. coli по методу О’Фаррелла [O’FarreU, 1975]
мембраной, поскольку в присутствии детергента 4%-ный ПААГ недостаточно прочно связывается со стеклом. Католитом служил 0,02 М NaOH, анолитом— 0,01 М. Н3Р04; оба раствора деаэрировали и хранили в вакууме. Анод располагался внизу.
