Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Предфокусирование для очистки геля от радикалов проводили в три этапа: 15 мин при напряжении 200 В, затем по 30 мин при 300 и 400 В. После этого католит сливали. Препарат, содержавший 10—20 мкг белка лизата Е. coli, после обработки ДНКазой вносили на гель в объеме 25 мкл раствора, содержащего 9,5 М мочевины, 2% NP-40 и 5% p-меркаптоэтанола (буфер лизиса клеток). В этом растворе все белковые агрегаты диссоциируют, а сами белки денатурируют. На препарат наслаивали 10 мкл 9 М раствора мочевины, содержавшего 1% смеси амфолинов в той же пропорции (4:1). Вместо сахарозы высокую плотность здесь создает мочевина. Затем трубку осторожно дополняли доверху католитом (0,02 М NaOH). ИЭФ при напряжении 400 В занимало 12 ч; еще на 1 ч напряжение увеличивали до 800 В. По окончании ИЭФ гель выдавливали из трубки и для подготовки его к электрофорезу вымачивали 2 ч при комнатной температуре со встряхиванием в 5 мл 0,5 М. Трис-НС1 (pH 6,8), содержащего 0,4% ДДС-Na.
Во втором направлении белки разделяли ступенчатым электрофорезом в пластине ПААГ размером 13x14 см и толщиной 0,8 мм. В качестве рабочего геля до уровня на 2,5 см ниже верхнего края пластины полимеризовали экспоненциальный градиент (5—22,5%) ПААГ в 0,375 М Трис-НС1 (pH 8,8) с добавлением 0,1% ДДС-Na, стабилизированный глицерином. Формирующий гель представлял собой 4,75%-ный ПААГ, полимери-зованный в 0,125 М Трис-НС1 (pH 6,8) с 0,1% ДДС-Na. Клиновидную полость над пластиной для помещения в нее цилиндрика геля первого направления формировали так, как это принято делать при двумерном электрофорезе [Остерман, 1981]. Эту полость заполняли расплавленным 1%-ным раствором агарозы в том же буфере, а затем закладывали в нее цилиндрик геля. В качестве верхнего электродного буфера использовали, как обычно при электрофорезе по Лэммли, раствор, содержащий 0,025 М Трис, 0,192 М глицин и 0,1% ДДС-Na (pH 8,3) с добавлением бромфенолового синего в качестве лидирующего красителя. Электрофорез длился 5 ч при силе тока 20 мА. За это время полоса красителя достигала нижнего края пластины. Для окрашивания белков после электрофореза использовали 0,1%-ныЙ раствор СВВ R-250 в 50%-ной ТХУ. Перед авторадиографией гель высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой от суток до месяца в зависимости от исходной радиоактивности препарата и необходимости выявления слабых пятен. При этом следует иметь в виду, что при увеличении продолжительности экспозиции увеличивается и размер каждого пятна — примерно вдвое при 10-кратном удлинении экспозиции. Соответственно может ухудшаться разрешение близко лежащих пятен.
Во время вымачивания цилиндрика после ИЭФ до 25% белка может вымываться из геля, поэтому О’Фаррелл описал вариант методики без промежуточного вымачивания. При этом цилиндрик геля не заплавляли в агарозу, а в верхний электродный буфер вносили первоначально 2% ДДС-Na, впоследствии заменяя его нормальным буфером, содержащим 0,1% ДДС-Na.
Исходное количество препарата О’Фаррелл варьировал в пределах от 1 до 100 мкг белка. В последнем случае преобладающие белки смеси давали явно перегруженные пятна, но зато могли быть обнаружены белки, содержание которых в исходном препарате было очень низким. Оптимальное количество белка в одном пятне — примерно 0,1 мкг. При перегрузках (более 20 мкг исходной смеси) наблюдались существенные искажения формы некоторых пятен. Обнаруживалось и явление вытеснения белков друг другом — малое пятно при близком соседстве большого оттеснялось из своего нормального положения.
При окраске СВВ R-250, хотя и с трудом, но удавалось обнаружить пятна, содержащие до 0,01 мкг белка. С учетом ограничения исходной загрузки геля это позволяло обнаружить лишь около 400 белков Е. coli. Авторадиография при 20-дневной экспозиции дает возможность зарегистрировать пятна, содержа-
щие радиоактивный 14С на уровне 1 имп./мин. При радиоактивности исходного белкового препарата порядка 5Х106 имп./мин это позволяло получить картину, показанную на рис. 14, где обнаруживались белки, представленные в бактериальной клетке (как показывает расчет) одной-единственной молекулой.
Использование высокой концентрации мочевины на всех этапах процесса, начиная с лизиса клеток, необходимо для устранения угрозы агрегации белков. Как всегда, при этом следует опасаться распада мочевины и карбамоилирования белков, что приведет к появлению мультиплетов пятен, расположенных рядом, на одном уровне пластины. Ввиду этого растворы особо чистой мочевины должны быть свежеприготовлены или храниться в замороженных аликвотах. Замечено, что в продажных препаратах мочевины даже наивысшей чистоты встречаются примеси солей, способствующих агрегации белков [Goldsmith et al.,
1979], поэтому растворы мочевины следует обязательно деионизировать на ионообменных колонках, как описано выше.
Дублеты и мультиплеты пятен могут также явиться следствием неконтролируемых модификаций белков, ведущих к изменению их pi (окисления остатков цистеина, дезамидирования остатков аспарагина и глутамина и др.). Замечено, в частности, что дублеты появляются при хранении замороженной бактериальной массы при —20° в течение месяца, а в случае лиофилизи-рованных экстрактов Е. coli — за то же время при —70°.
