Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
«Уравновешенную» таким образом полоску геля первого направления на той же полиэтиленовой пленке переносят в форму, где уже полимеризован гель второго направления. Одна из двух стеклянных пластинок формы сделана более длинной, чем другая. К выступающей сверху ее части прижимают пленку с гелем, а затем осторожно шпателем сдвигают полоску с пленки и вводят ее между пластинками формы, постепенно и равномерно прижимая к торцу формирующего геля второго направления. Этот торец должен быть обсушен фильтровальной бумагой, иначе белки смогут выходить из полоски геля и смешиваться, диффундируя вдоль слоя жидкости между полоской и гелем. После установки полоски ее фиксируют заливкой расплавленной агарозой.
Недавно описано двумерное фракционирование белков по методу О’Фаррелла с использованием ультратонких гелей. В первом направлении ИЭФ проводили в пластине толщиной 0,24 мм, а электрофорез второго направления — в пластине толщиной 0,36 мм [Gorg et al., 1980].
Также без детергента проводили ИЭФ бромциановых пептидов миозина Эпштейн и Вольф [Epstein, Wolf, 1976]. Для предупреждения возможности неконтролируемого окисления остатков метионина и цистеина радикалами персульфата аммония (что приводит к появлению дополнительных пятен) пептиды окисляли надмуравьиной кислотой. Трубки после ИЭФ разрезали на продольные слои толщиной 2 мм. Средний слой заполиме-
ризовывали в гель второго направления, а крайние использовали для контрольного окрашивания и измерения pH.
Для фракционирования крупных белков (М>200000) Хи-рабайяши проводил ИЭФ в первом направлении в 1%-ном геле агарозы. В трубку диаметром 2,5 мм и длиной 26 см он для ускорения формирования градиента pH заливал последовательно три слоя агарозы: кислый с амфолитами диапазона pH 2,5—5 на высоту 2 см, нейтральный (pH 3—10) на 11,5 см и щелочной (pH 8—10,5) на 4,5 см. Трубка с нижнего конца была закрыта диализной мембраной, и каждый новый слой расплавленной агарозы заливали после застывания предыдущего, NP-40 не использовали, но в каждом слое содержались 7 М мочевина и 0,66 М сорбит. Фокусирование при напряжении 500 В занимало 24 ч при 4°. По его окончании гель выталкивали в другую трубку диаметром 5 мм, заполненную 10%-ным раствором ТХУ с 5% сульфосалициловой кислоты. Этот раствор прокачивали через трубку в течение часа. Мочевина и амфолиты вымывались, а полосы выпавших в осадок белков можно было фотографировать при боковом освещении на темном фоне. Затем столбик геля промывали водой и выталкивали в слой воды над формирующим гелем системы Лэммли для электрофореза во втором направлении. Воду отсасывали, а столбик агарозы фиксировали заливкой 1%-ным агаром. Растворение и обработка белков ДДС-Na происходили в ходе электрофореза. Для этого на столбик агарозы (на высоту 5 мм) наслаивали 2%-ный раствор ДДС-Nia в буфере, содержавшем 5% p-меркаптоэтанола [Hira-bayashi, 1981].
При фракционировании белков гладкого эндоплазмэтического ретикулума оказалось, что их растворение с помощью-NP-40 происходит не полностью. Власук и Вальц обнаружили, что полного растворения этих белков можно добиться совокупностью следующих мер: заменой NP-40 на Тритон Х-100, увеличением концентрации мочевины до насыщающей и закислени-ем лизирующего буфера до pH 4,3 соляной кислотой. Около 130 мг растворенного таким образом белка они вносили на гель после формирования в нем градиента pH, причем с анодного его конца (в отличие от метода О’Фаррелла). Это устраняло агрегацию и преципитацию белков на границе геля. Пропорцию амфолинов изменяли почти на обратную: 0,5% диапазона pH 6—8 и 1,5% диапазона pH 3—10. ИЭФ в этих условиях обнаруживало 55 полос, а после электрофореза во втором направлении выявлялось 230 пятен белков, входящих в состав гладких мембран [Vlasuk, Walz, 1980].
Аналогичный прием был использован и в другой работе [Stephenson et al., 1980]. Ее авторы исследовали гидрофобные белки внутренней мембраны митохондрий дрожжей. В присутствии циклогексимида, блокирующего синтез белков в цитоплазме, белки митохондрий метили “S, а затем экстрагировали и фракционировали в первом направлении методом ИЭФ в 4%-ном
ПААГ, полимеризованном в присутствии 8 М мочевины и 2% Тритона Х-100. В смесь вносили по 0,6% амфолинов каждого из трех диапазонов pH; 3,5—10, 2,5—4 и 9—11. В качестве като лита использовали 0,66 М раствор этиленди амина, в качестве анолита— 0,1 М раствор лимонной кислоты. Для уменьшения •осмотического различия между гелем и электролитами в последние тоже вносили мочевину до концентрации 8 М. Для растворения белков авторам пришлось использовать даже ДДС-Na, хотя и в умеренной концентрации (2:1 по отношению к белку), а pH лизирующего буфера они снижали до 3,0 добавлением лимонной кислоты. Небольшое количество ДДС-Na в препарате не мешало процессу ИЭФ, тем более что и в этом случае препарат вносили с анодного конца геля, где свободный ДДС-Na быстро уходит к аноду, а из связи с белком его вытесняет избыток Тритона Х-100. Амфолины в раствор препарата не вносили, так как это расширило бы градиент pH за физические размеры геля и привело бы к сужению интервала pH в нем. Предфокуеирование геля перед внесением препарата занимало 10 мин. На препарат в трубке наслаивали 10 мкл раствора, содержащего 6 М мочевину, 2%-ный Тритон Х-100 и 0,01 М лимонную кислоту. Затем следовал анолит (анод — вверху). ИЭФ проводили при силе тока 1 мА в течение примерно 40 мин, пока напряжение не увеличивалось до 600 В. При этом напряжении ИЭФ продолжали еще 4 ч (сила тока падала до 0,18 мА). Затем для обострения полос напряжение на последние 15 мин увеличивали до 800 В.
