Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
МОДИФИКАЦИИ МЕТОДА О’ФАРРЕЛЛА
Вымачивание цилиндриков геля после ИЭФ по методу О’Фар-релла приводит не только к потере части белков, но и к некоторому размыванию белковых зон. Кроме того, если желательно при электрофорезе во втором направлении на одной пластине сопоставить белки, сфркусированные в разных опытах, то зоны этих белков приходится вырезать вслепую.
Недавно было показано [Jackie, 1978], что все эти трудности можно обойти путем кратковременной фиксации и окраски белковых полос в цилиндрике геля после ИЭФ таким образом, чтобы это не мешало последующему электрофорезу. По окончании ИЭФ по О’Фарреллу белки фиксировали и окрашивали в течение 10 мин 0,1%-ным СВВ R-250 в растворе, содержащем 10% СН,СООН и 50% метанола. Отмывали гель 1 ч в том же растворителе, а затем в смеси, содержащей 7% СН3СООН, 5% метанола и 0,005% СВВ R-250 (последнее для предотвращения десорбции красителя с белка). Фиксированный таким образом цилиндрик геля можно хранить неделями. Перед фракционированием во втором направлении цилиндрик в течение 2 ч вымачивали в 5 мл раствора, содержащего 0,625 М Трис-НС1 (pH 6,5), 2,3% ДДС-Na, 5% р-меркаптоэтанола и 10% глицерина, а далее проводили электрофорез так, как описано О’Фарреллом. При выдерживании геля в 2,3%-ном ДДС-Na
осажденные белки вновь растворяются и нормально мигрируют в электрическом поле пластины. Краска от белков отделяется к под действием поля уходит к аноду впереди всех белков. Описанный способ окрашивания открывает возможность сравнения между собой белков, сфокусированных в разных опытах. Для этого их зоны надо вырезать из соответствующих замороженных гелей после ИЭФ и собрать вместе — в ряд карманов пластины: для электрофореза во втором направлении.
Разрешающая способность метода О’Фаррелла может быть увеличена за счет удлинения каждого из двух направлений фракционирования. Борис и Юнг проводили ИЭФ в трубках длиной 33 см с внутренним диаметром 3 мм, а для электрофореза использовали пластины размером 40X40 см [Voris, Young,
1980]. Трубки заполняли с помощью пастеровской пипетки, внимательно следя за отсутствием пузырьков воздуха. Предфокуси-рование и ИЭФ проводили при тех же значениях напряженности электрического поля, что и О’Фаррелл, т. е. при напряжении, в 2,5 раз большем. Соответственно и время ИЭФ увеличивали до 20 ч. От стенок трубки гель отслаивали тонкой полиэтиленовой трубочкой, накачивая в нее воду, что придает ей некоторую жесткость.
В одной из стеклянных пластинок формы для геля второго-направления делали вырез, подобно тому как это предусмотрено в приборе Стадиера для электрофореза в вертикальных пластинах [Остерман, 1981]. Верхний электродный резервуар и» плексигласа (который при ИЭФ не должен быть объемистым) имел точно такой же вырез в передней стенке. Этот резервуар через резиновые прокладки зажимами крепили прямо на пластинки геля, совмещая вырезы. При полимеризации верхнего,, формирующего геля на поверхность раствора в вырез пластинки укладывали стеклянную палочку диаметром 3 мм (при толщине геля 0,8 мм). Таким образом, на торце геля после полимеризации образовывался желобок. В него с листа парафильма скатывали длинный и тонкий цилиндрик геля, расправляли его и заливали расплавленным 1%-ным раствором агарозы. Пластину геля до уровня верхнего резервуара погружали в 20-литровый аквариум, заполненный нижним электролитом. Электрофорез вели в течение 10 ч при силе тока 50 мА. После фракционирования 20 мкг белка из клеток тимуса крысы с исходной ‘‘С-радиоактивностью 5* 10е имп./мин авторадиография при двухнедельной экспозиции выявляла 1750 пятен. В том же объекте при использовании гелей обычного размера обнаруживаются только 500 пятен.
Неионный детергент NP-40, используемый О’Фарреллом, необходим только для полного растворения всех (в том числе крупных и гидрофобных) белков бактериальной клетки. Эта необходимость отпадает при фракционировании легко растворимых белков, например низкомолекулярных. В подобной ситуации Голдсмит и соавторы при ИЭФ в первом направлении
вовсе исключили детергент, уменьшили концентрацию мочевины до 8 М и использовали 5%-ный ПААГ [Goldsmith et al., 1979]. Это позволило им вести ИЭФ не в трубке, а в горизонтальной пластине толщиной 1 мм одновременно для нескольких сопоставляемых препаратов. Препараты вносили с дубликатами, так что один из двух треков каждого препарата можно было вырезать, окрасить и использовать для сопоставления с картиной ИЭФ остальных препаратов.
Для улучшения разделения низкомолекулярных белков в 10%-ном ПААГ второго направления в рабочий буфер системы Лэммли авторы вводили еще и 6,4 М мочевину. Особых мер предосторожности требует операция вымачивания полоски геля после ИЭФ в растворе, содержащем 0,063 М Трис-НС1, 1% ДДС-Na и 10% ji-меркаптоэтанола. Здесь легко потерять много белка, поскольку его молекулы имеют небольшие размеры и легко диффундируют. Авторы цитируемой работы отработали следующую, довольно сложную процедуру «вымачивания» и переноса геля. Полоску, вырезанную из пластины первого направления, кладут на полиэтиленовую пленку и по ней пипеткой равномерно распределяют всего лишь 1 мл указанного буфера. Жидкость вне полоски немедленно отсасывают пастеровской пипеткой. Всего лишь одна минута промедления приводит к заметной потере белка.
