Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами" -> 20

Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами — М.: Наука, 1983. — 296 c.
Скачать (прямая ссылка): isledovaniebiologicheskihmakromolekul1983.djvu
Предыдущая << 1 .. 14 15 16 17 18 19 < 20 > 21 22 23 24 25 26 .. 140 >> Следующая

Авторы определили следущие значения pi для пяти главных гистонов: 8,9 Для Н1, 9,8 для НЗ, 9,9 для Н2В, 10,1 для Н2А и 10,25 для Н4. Всего было обнаружено 12 полос главных гистонов и субфракций. На рис. 12 картина ИЭФ гистонов сопоставлена с их электрофореграммой в ПААГ. Преимущества ИЭФ в отношении качества фракционирования очевидны.
ИЭФ В ГОРИЗОНТАЛЬНЫХ ПЛАСТИНАХ АГАРОЗЫ
ПААГ малой концентрации вполне пригоден для ИЭФ белков относительно небольшой молекулярной массы. В случае крупных белков ненужное при ИЭФ трение о гель существенно замедляет достижение равновесия, поэтому предпочтение следует отдать крупнопористым и прочным гелям агарозы2. До последнего времени использование даже специально разработан-йой агарозы марки «LE» (фирмы «Miles») было связано со значительно большим, чем у ПААГ, уровнем эндосмоса. Недавно фирма «LKB» выпустила в продажу предназначенную специально для ИЭФ агарозу марки «Agarose-EFs> с очень слабо выраженным эндосмосом (тг=—0,005). Такая агароза вполне пригодна для фокусирования белков с молекулярной массой до 900 тыс., например иммуноглобулинов типа IgM. Аналогичный, хотя и несколько хуже очищенный препарат, поставляет фирма «Serva» под маркой «Agarose Serva without ЕЕО» (mr = —0,01).
И4
¦
иг а нгв нз
\ \ I
И1°
Н1
1
по
CZI
И4 яг А И2В HJ
иг
Я1
Рис. 12. Фракционирование гистонов в трубках ПААГ с помощью электрофореза (Л) и ИЭФ (Б) [Valkonen, Piha, 1980]
Фирма «Pharmacia» недавно начала выпуск агарозы для ИЭФ под маркой «Agarose IEF». В максимально очищенную агарозу, содержащую, тем не менее, неизбежный минимум отрицательных зарядов, фирма вносит строго дозированное количество прочно связанных с матрицей положительно заряженных групп. В результате такой обработки эндосмос при использовании этой агарозы сведен почти до нуля. Точнее, он практически отсут-
2 Впрочем, до сих пор недостаточно изучены возможности использования для ИЭФ полиакриламидных гелей, сильно сшитых (С>20) диаллилтартардиа-мидом. Такие гели имеют крупные поры, легко пропускающие молекулы с миллионной массой; они прозрачны и к тому же растворимы в йодной кислоте [Остерман, 1981].
ствует для фармалитов в диапазоне pH 5—8. Для узких диапазонов pH в щелочной области «катодный дрейф» градиента pH все же имеет место, а в узких диапазонах кислой области вместо него наблюдается «анодный дрейф» — градиент постепенно сдвигается в сторону анода. По-ви-цимому, степень протонирования положительно заряженных групп в агарозе за- рис. 13. Укладка геля агарозы на висит от pH. Для фармали- охлаждающий столик прибора «Муль-тов диапазона pH 3—10 гра- тифор* диент pH в ходе ИЭФ становится более пологим, чем первоначальный, так как щелочная его часть дрейфует к катоду, а кислая — к аноду.
Уже упоминалось, что эффект эндосмоса снижается при увеличении вязкости пронизывающей гель жидкости. В гелях агарозы для этой цели обычно используют сорбит в концентрации 10—12%. Его растворяют в воде, затем насыпают на поверхность раствора сухую агарозу, дают ей набухнуть и осесть и, как обычно, нагревают раствор на кипящей водяной бане до тех пор, пока не прекратится выделение пузырей воздуха, что свидетельствует о полном растворении агарозы. Колба с раствором при этом должна быть хорошо закрыта. Амфолиты вносят перед заливкой, после охлаждения раствора до 60—70°.
Заливать пластину удобно открытым способом, нанося дозированный объем раствора агарозы с амфолитами из подогретой пипетки на пластмассовую подложку, установленную строго горизонтально с помощью регулируемого по уровню столика. Во избежание быстрого и неравномерного застывания агарозы между подложкой и столиком целесообразно положить теплоизолирующую прокладку. Пластина агарозы после полимеризации легко снимается с подложки. При концентрации агарозы 0,8—1% она достаточно прочна, чтобы быть в свободном состоянии перенесенной на охлаждающую плиту прибора для горизонтального электрофореза (рис. 13). Впрочем, фирма «Pharmacia» предлагает и другой вариант. Она поставляет специальные пластмассовые подложки «Gel Bond», на которых путем особой обработки прочно закреплен тонкий слой агарозы. После заливки, которую фирма рекомендует осуществлять с помощью ограничительной рамки, гель агарозы прочно пристает к подложке и далее всю обработку, включая высушивание, проводят на ней. Как и при электрофорезе, пластины агарозы перед использованием для завершения полимеризации следует выдерживать на холоду во влажной камере в течение суток.
Установку пластины геля агарозы в прибор для горизонтального электрофореза, наложение полосок фильтровальной бумаги, пропитанных электролитами, и электродов производят точно так же, как было описано для пластин ПААГ. Отметим только, что в качестве анолитов не следует использовать концентрированные растворы сильных кислот, так как они могут растворять агарозу. Фирма «LKB» рекомендует для этой цели 0,5 М раствор уксусной кислоты, а фирма «Pharmacia» — 0,05 М раствор серной кислоты. В качестве католита можно употреблять
Предыдущая << 1 .. 14 15 16 17 18 19 < 20 > 21 22 23 24 25 26 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed