Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка):
2. Клетки переносят в универсальный контейнер и затем медленно, по
каплям, добавляют 2 мл теплой (37 °С) среды H-RPMI.
3. Закрывают контейнер крышкой и перемешивают содержимое. Центрифугируют
в течение 5 мин приблизительно при 500 g.
4. Удаляют супернатант, заливают клетки 4 мл среды ГАТ и помещают
суспензию в две лунки панели для культуры тканей объемом 2 мл.
5. Паиели инкубируют в термостате с регулируемым составом атмосферы, а
затем рассевают клетки. Жизнеспособность клеток обычно составляет 50-78%
при условии, что была заморожена здоровая, хорошо растущая (непереросшая)
куль-гура.
Время от времени необходимо проверять содержание специфических антител в
культуральной жидкости с помощью определенного набора контрольных
антигенов. Очень важно оценить не только уровень специфических антител,
но и возможных примесей. Обнаружение последних может быть обусловлено
загрязнением гибридомы клетками другой линии, что легко может случиться,
когда одновременно культивируют много линий.
' Асцитные жидкости можно хранить в замороженном виде, но в этом случае
отпадает необходимость в соблюдении стерильности (препараты будут
использованы для последующих в/б инъекций), которая должна быть
обеспечена при замораживании клеток для последующего культивирования in
vitrp. После центрифугирования асцитной жидкости осадок ресуспен-дируют в
PBS, а не в среде ГАТ.
Ю*
/
148_________________________________________ Глава 3 /
Самый простой путь определения концентрации моноклональных
иммуноглобулинов в асцитных жидкостях - электрофорез с последующим
окрашиванием гелей. На электрофоре-грамме должны быть видны отдельные
полосы, характеризующиеся определенным положением в случае антител данной
специфичности. Их интенсивность можно сравнить с интенсивностью полос,
полученных при исследовании проб, отобранных на более ранних пассажах.
Данный метод более удобен и информативен, чем титрование специфических
антител, хотя время от времени следует применять и последний.
9. Применение моноклональных антител
Клиническое и экспериментальное применение моноклональных антител
разнообразно и многочисленно. Ряд обзоров полностью посвящены этой теме и
могут быть рекомендованы читателю [2, 4, 6]. Здесь мы рассмотрим
практические выводы, имеющие отношение к использованию моноклональных
антител.
Во-первых, в зависимости от области применения существует возможность
выбора наиболее подходящего и удобного источника получения моноклональных
антител: культуральной
или асцитной жидкости. При использовании препаратов асцитной жидкости
возникают определенные трудности при интерпретации полученных
результатов, обусловленные примесью естественных мышиных антител к
моноклональным антителам (высокие фоновые уровни). Однако в 1 мл асцитной
жидкости содержится несколько мг МКА. Поэтому, когда используют
разведение 1 :1000 или более, значительная часть посторонних мышиных
антител удаляется разбавлением. Иногда необходимо полностью удалить из
препарата примесь естественных иммуноглобулинов (например, при
использовании моноклональных антител для выделения и очистки небольшого
количества белкового антигена с целью биохимического анализа). В
последнем случае предпочтительно выделять моноклональные антитела из
культуральной жидкости. При использовании в иммунологических реакциях
асцитной жидкости следует иметь в виду присутствие посторонних фоновых
антител. В некоторых случаях в организме мыши может существовать высокий
титр природных антител, реагирующих с антигеном, специфически
распознаваемым моноклональными антителами. При использовании асцитной
жидкости возникают и проблемы неспецифического характера. Например,
культуральная жидкость дает более ясное и точное окрашивание образца в
иммуногистологических исследованиях.
Культуральная жидкость представляет собой удобный и адекватный источник
моноклональных антител с целью исполь-
Моноклональные антитела мыши
149
зования их для идентификации антигена как в собственной лаборатории, так
и для снабжения этим реагентом коллег. При использовании одной капли
чистой культуральной жидкости на тест, 10 мл достаточно для проведения
приблизительно 200 тестов. Если моноклональные антитела получают
коммерческим путем или используют в крупномасштабных исследованиях в ряде
центров, то наиболее экономичным источником их получения служит асцитная
жидкость. При использовании одной капли на тест и при работе с
разведением около 1 : 103, 1 мл хватает на 20 000 тестов. В этом случае
моноклональные антитела обычно выделяют из асцитной жидкости в виде
иммуноглобулиновой фракции.
В разд. 5 мы рекомендовали выбирать метод скрининга, адекватный
использованию МКА. Следует иметь в виду, что в неадекватных системах МКА
иногда не обнаруживают антигена. Например, моноклональные антитела к
растворимым белкам, отобранные методом пассивной гемагглютинации с
помощью эритроцитов, нагруженных антигеном, могут распознавать только
