Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 61

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 55 56 57 58 59 60 < 61 > 62 63 64 65 66 67 .. 122 >> Следующая

лунки шестого ряда - по 100 мкл суспензии с концентрацией 5 клеток в 1 мл
(1 клетка на каждые две лунки). Конечная концентрация 2-меркаптоэтанола в
лунках, содержащих спленоциты и гибридные клетки, составляет 60 мкМ.
7. Переносят панель в С02-термостат и повторяют описанную процедуру для
второй лунки с клетками, выбранной на панели с первыми разведениями.
8. Меняют в лунках среду, если она в результате роста колоний
закислилась. При этом следует соблюдать осторожность, чтобы не нарушить
клеточный слой, поскольку гибридные клетки будут затем расти на фидерном
слое спленоцитов в виде отдельных колоний. При смене среды необходимо
избегать перекрестной контаминации лунок.
9. Через 10-14 дней гибридные клоны следует осмотреть невооруженным
глазом, а затем более тщательно, с помощью инвертированного микроскопа
под малым увеличением, чтобы различить отдельные белые пятна в лунках.
Записывают число колоний, растущих в каждой лунке. Лучше отбирать
колонии, выросшие в тех лунках, которые засевали из расчета 1-0,5 клеток
на лунку. Однако если эффективность роста данной линии низка, то,
возможно, придется выбирать клон из лунок, в которые было посеяно по 10-5
клеток на лунку, при условии присутствия в лунке только одного клона.
10. Когда колонии ясно видны невооруженным глазом, они обычно достаточно
большие, чтобы проверить их антителообразующую активность. На.этой стадии
проверяют супернатанты со всей панели. Затем снова, если возможно,
проверяют неразбавленный супернатант, а также одно или два разведения.
Отбирают три отдельные колонии, которые продуцируют высокие титры
антител. Предпочтительно выбирают колонии из тех рядов, в которые
изначально клетки были рассеяны из расчета I или 0,5 клеток на лунку.
6.4.3. Третья стадия метода лимитирующих разведений
Чтобы быть уверенными, что данные клоны получены из одной клетки, а не из
двух, целесообразно повторить описанную выше процедуру второй стадии
метода лимитирующих разведений для каждой из трех отобранных колоний.
Повторение процедуры клонирования единичных клеток имеет и то
преимущество, что при проверке индивидуальных колоний, полученных после
третьей стадии процедуры лимитирующих разведений, они все должны
продуцировать антитела. Таким образом, гиб-
lit
Глава 3
I
ридомная линия, которую в конечном итоге наращивают до значительных
объемов, - это линия, которая образовалась из одной клетки. Целесообразно
пересадить три отдельные колонии после осуществления второй стадии метода
лимитирующих разведений, поскольку одна или две колонии могут отличаться
низкой эффективностью роста. Перенеся три колонии, вы можете быть
уверены, что нарастите достаточно клеток для анализа на третьей стадии
метода лимитирующих разведений.
Колонии, возникшие из одной-единственной клетки, выращенные на третьей
стадии и проанализированные на секрецию антител, переносят в новые панели
для микротитрования. При известных обстоятельствах предпочтительно
сначала вести линию в лунках панели для микротитрования, затем в 2-мл
лунках и далее, наконец, в небольших флаконах. По крайней мере 10 ампул
следует заморозить в жидком азоте для хранения.
6.4.4. Замечания по процедуре разаедения
На первый взгляд кажется, что описанная выше процедура требует много
времени. Результат оказывается наиболее хорошим, если проверяют одно или
два разведения супернатанта из каждой лунки и, таким образом, оценивают
титр антител. Соответственно в процессе клонирования могут быть отобраны
клетки, продуцирующие возрастающее количество антител. В нашей
лаборатории с целью отбора проб для приготовления разведений в
нестерильных панелях для микротитрования, а также последующего переноса
проб в панели для проведения РИА мы используем многоканальную пипетку.
Благодаря этому исследование 48 проб из каждой панели занимает совсем
немного времени. Имея соответствующие навыки, процедуру лимитирующих
разведений можно осуществить за короткое время.
Очень важно детально описывать все этапы культивирования клеток и
регистрировать содержание антител в культуральной жидкости во время роста
гибридом и по ходу экспериментов по клонированию.
7. Выделение антител из культурального супернатанта и из асцитной
жидкости
Моноклональные антитела, полученные с помощью гибридомной технологии,
можно выделять из двух источников.
7.1. Культуральная жидкость
Культуральная жидкость не содержит других мышиных иммуноглобулинов, кроме
моноклональных антител, но, разумеется, содержит большое количество
белков СПК. Концентрация
Моноклональные антитела мыши 145'
антител в культуральной жидкости обычно составляет несколько мкг в 1 мл.
Для получения чистых моноклональных антител все большее применение
находят современные бессывороточные культуральные среды.
Для достижения оптимального содержания антител в культуральной жидкости
гибридомные клетки растят до высокой плотности (культуральная среда
становится при этом желтой). Однако важно не допустить того, чтобы клетки
Предыдущая << 1 .. 55 56 57 58 59 60 < 61 > 62 63 64 65 66 67 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed