Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 57

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 51 52 53 54 55 56 < 57 > 58 59 60 61 62 63 .. 122 >> Следующая

таким образом, отобрать положительные клоны на фоне контамини-
Моноклональные антитела мыши
135
рующих антител, продуцируемых выживающими клетками селезенки.
2. Тест необходимо по возможности автоматизировать для быстрого скрининга
большого количества проб из лунок. Этого можно достичь, используя
многоканальную пипетку (8 проб за один раз) и проводя тестирование в
планшетах.
3. Чувствительность теста должна составлять менее 1- 10 мкг антител в 1
мл. Учитываемые величины должны превышать фон не менее чем в 3 раза.
4. Результаты скрининга должны быть известны исследователю не позднее
следующего дня, чтобы своевременно уделить внимание нужным клонам и
предупредить перерастание клеток.
5. Важна достоверность результатов, поэтому процедура скрининга должна
предусматривать постановку положительных и отрицательных контролей.
6. Если используют антитела к иммуноглобулинам мыши" меченные
флуоресцеином, пероксидазой или 1251 (антиглобули-новый реагент), то
следует тщательно проверить их специфичность по отношению к чистым белкам
соответствующих подклассов (IgGi, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM).
7. С учетом того что в процессе скрининга исследуют большое количество
проб, рекомендуется проводить скрининг, используя недорогостоящие
реагенты и оборудование.
Помните, что необходимо отбирать для анализа супернатанты из лунок с
хорошим ростом гибридом: такая проба будет содержать оптимальное
количество антител. Очень простой радиоиммунологический метод может быть
использован для тестирования адекватных уровней антител в супернатантах и
для повседневного контроля за образованием антител в лунках [13]. Особую
ценность данный метод приобретает в том случае" если наблюдается рост в
большом числе лунок, а скрининг супернатантов еще не дает положительных
результатов. Обнаружение с помощью антиглобулиновых реагентов
значительных титров антител означает, что чувствительность первичного
скрининг-теста недостаточна и его необходимо усовершенствовать. Если
выявляют мышиные иммуноглобулины в незначительной концентрации, то
необходимо подождать, пока гибридомные клетки вырастут, а затем взять
повторные пробы для скрининга. Можно сконцентрировать анализируемые
супернатанты, хотя обычно в этом нет необходимости.
Суммируя вышесказанное, можно утверждать, что тесты, обычно используемые
в лаборатории при исследовании поликлональных сывороток с высокими
титрами антител, могут быть адаптированы для скрининга гибридом.
Некоторые из них могут оказаться довольно сложными; например, цель
исследователя может заключаться в получении моноклональных анти-
136
Глава 3
тел, которые определяют по торможению-функции в каком-либо биологическом
тесте. При использовании сложных и продолжительных тестов целесообразно
уменьшить количество анализируемых проб. Для идентификации
антителопродуцирующих клонов может быть использована простая процедура
скрининга мышиного иммуноглобулина, а затем уже только эти пробы вместе с
отрицательным контрольным супернатантом исследуют более сложным путем.
При получении антител к поверхностным клеточным антигенам мы обнаружили,
что примерно в половине лунок с растущими клонами образуются мышиные
иммуноглобулины, а примерно половина или более содержащих антитела
супернатантов реагировала положительно с клетками, использовавшимися для
иммунизации.
5.1. Процедуры скрининга при получении антител
к антигенам клеточной поверхности и другим корпускулярным антигенам
Существует определенная схема выявления специфического связывания антител
с антигеном. Клетки-мишени могут быть живыми, зафиксированными глутаровым
альдегидом, высушенными на стекле или же присутствовать в замороженных
гистологических срезах. Тест неизбежно является непрямым, и реагентом для
второй стадии могут служить антимышиные иммуноглобулины овцы, козы или
кролика, меченные флуоресцеи-ном, ферментом или радиоактивным иодом.
Обычно пробу (одну каплю) супернатанта добавляют к 0,5-10(r) клеток-мишеней
в небольшом объеме в маленькой пластиковой пробирке или в лунке панели.
После 30-60 мин инкубации при 4°С суспензию разбавляют, клетки осаждают
центрифугированием, отмывают один раз и инкубируют в течение 30 мин при
4°С с соответствующими разведениями поливалентного антимышино-го
иммуноглобулина, конъюгированного с флуоресцеином. Клетки вновь отмывают
и регистрируют флуоресценцию непосредственно под флуоресцентным
микроскопом или с помощью проточного цитофлуориметра системы FACS [14].
Более детально упоминаемые процедуры скрининга изложены в кн. 2.
5.2. Процедуры скрининга при получении антител
к растворимым антигенам
Основные альтернативные тесты - это ELISA, РИА или реакция
гемагглютинации. В первых двух случаях в лунках пластиковой панели для
микротитрования адсорбируют антиген (1 ч) и затем отмывают остаток
несвязавшегося антигена. Далее в каждую лунку вносят по одной капле
исследуемого
Моноклональные антитела мыши
137
супернатанта. Инкубацию продолжают в течение 30 мин или ночи, после чего
Предыдущая << 1 .. 51 52 53 54 55 56 < 57 > 58 59 60 61 62 63 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed