Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 60

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 54 55 56 57 58 59 < 60 > 61 62 63 64 65 66 .. 122 >> Следующая

Моноклональные антитела мыши
141
ках, в которые предварительно засеяли по одной клетке, может быть просто
проконтролировано. Метод лимитирующих разведений легко воспроизводится.
Он позволяет избежать проблем, связанных с технологией приготовления
агара, когда эффективность клонирования часто зависит от качества агара и
его консистенции.
Метод лимитирующих разведений - это трехстадийная процедура. Поэтому для
получения клонированных клеточных линий с его помощью требуется больше
времени.
6.4.1. Первая стадия метода лимитирующих разведений
В процессе клонирования необходимо отобрать наиболее жизнеспособные,
хорошо растущие гибридомы с высоким уровнем продукции антител. Цель
первой стадии - отделить субкультуру, характеризующуюся более высоким
уровнем продукции антител, от первоначальной культуры, которую выращивают
в лунках объемом 2 мл.
1. Помещают клетки гибридомы, взятые из первоначальной культуры, в панель
для микротитрования из расчета 100 клеток на лунку в 200 мкл среды ГАТ
(5-102 клеток в 1 мл).
Используют 48 центральных лунок панели (6 рядов по 8 лунок каждый).
Лунки, расположенные по периферии панели, заполняют средой RPMI-1640,
содержащей антибиотики (для предотвращения испарения влаги и
концентрирования среды ГАТ в лунках, содержащих клетки).
2. Инкубируют панель в С02-термостате с увлажненным воздухом.
3. Спустя приблизительно 7 дней, когда клетки в лунках практически
образуют монослой, исследуют супернатанты на содержание антител.
Целесообразно протестировать неразбавленный супернатант и, если возможно,
одно или два разведения (1 :4 и 1 : 16). Из тех лунок, где антитела
содержатся в наиболее высоких титрах, отбирают для клонирования
единичные, наиболее жизнеспособные и хорошо растущие клетки. Выбирают две
лунки, из которых клетки рассевают на второй стадии метода лимитирующих
разведений.
6.4.2. Вторая стадия метода лимитирующих разведений
Цель этой стадии - отобрать линии гибридных клеток, образовавшиеся из
одной клетки, и осуществить рассев гибридом на фидерный слой клеток
селезенки.
1. Готовят суспензию спленоцитов (как описано для процедур
гибридизации) за день до постановки эксперимента по
142
Глава 3
4-
клонированию и ресуспендируют клетки (10(r) клеток в 1 мл среды ГАТ,
содержащей 100 мкМ 2-меркаптоэтанола).
2. Оставляют клетки селезенки в универсальном контейнере на ночь при
комнатной температуре в ламинарном боксе для стерильных работ.
Преимущество этой процедуры заключается в том, что она позволяет
экспериментатору на следующий день проверить спленоциты под микроскопом и
убедиться, что они не загрязнены. Вероятно, это подавляет и рост фоновых
клеток селезенки в лунках, где проводят клонирование.
3. Подготавливают две панели для микротитрования следующим образом. Опять
используют только 48 центральных лунок панели (6 рядов по 8 лунок), а
расположенные по периферии заполняют средой RPMI-1640, содержащей
антибиотики. В 8 лунок первого ряда добавляют по 100 мкл полной среды
ГАТ. В 8 лунок каждого ряда (со 2-го по 6-й) добавляют по 100 мкл
суспензии клеток селезенки в концентрации 105 клеток на лунку.
4. Помещают обе панели в С02-термостат на время, необходимое для
приготовления последовательных разведений гибридных клеток. Очень важно
приготовить разведения и поместить их в панели как можно скорее. Если
клетки оставить на длительное время в суспензии (в которой число клеток
невелико), то они потеряют свою жизнеспособность. Две панели с повторными
разведениями готовят, используя клетки двух выбранных лунок первой
панели. Серии разведений двух популяций клеток гибридомы готовят
последовательно и отбирают клетки из лунок первой панели по мере
необходимости.
5. Готовят суспензии клеток в полной среде ГАТ: 1 мл суспензии с
концентрацией 103 клеток в 1 мл, 1 мл суспензии с концентрацией 102
клеток в 1 мл, 1 мл суспензии с концентрацией 50 клеток в 1 мл, 2 мл
суспензии с концентрацией 10 клеток в 1 мл и 1 мл суспензии с
концентрацией 5 клеток в 1 мл. Следует заметить, что готовят
последовательные разведения клеток, поэтому начать необходимо
приблизительно с 1,5 мл суспензии с концентрацией 103 клеток в 1 мл.
6. Достают одну из приготовленных панелей для микротитрования из
термостата. В каждую из восьми лунок первого ряда, который содержит
только среду ГАТ, добавляют по> 100 мкл суспензии с концентрацией 103
клеток в 1 мл. Таким образом, эти лунки содержат по 100 клеток, что
обеспечивает постоянный запас клеток, отбираемых из панелей с первым
разведением. В лунки второго ряда добавляют по 100 мкл суспензии с
концентрацией 102 клеток в 1 мл, поместив таким образом по 10 клеток на
лунку. Второй и все -последующие ряды содержат фидерный слой клеток
селезенки. В лунки третьего ряда добавляют по 100 мкл суспензии с
концентрацией 50 кле*
Моноклональные антитела мыши
143
ток в 1 мл (5 клеток на лунку), в лунки четвертого и пятого ряда - по 100
мкл суспензии с концентрацией 10 клеток в 1 мл (1 клетка на лунку) и в
Предыдущая << 1 .. 54 55 56 57 58 59 < 60 > 61 62 63 64 65 66 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed