Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 59

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 53 54 55 56 57 58 < 59 > 60 61 62 63 64 65 .. 122 >> Следующая

139
6.2. Процедура гибридизации Б
В том случае, когда клетки после слияния рассевают в лунки панели для
культуры ткани объемом 2 мл, вероятность того, что в одной лунке окажется
более одного клона, повышается. Просматривая культуры под инвертированным
микроскопом, можно наблюдать два и более клонов в лунке. Клонирование
клеток, продуцирующих антитела нужной специфичности, предпринимают
немедленно после образования монослоя (обычно па 21-28-е сутки после
гибридизации). Тем не менее гибридо-му продолжают наращивать в нескольких
лунках, а затем во флаконах, пока не образуется достаточное для
замораживания и хранения в жидком азоте количество клеток. Необходимо
иметь, по меньшей мере, пять ампул исходной клеточной взвеси на случай,
если возникнут трудности или неудачи при клонировании. Во время
культивирования гибридомы во флаконах культуральную среду тестируют для
выявления антител нужной специфичности. Если наблюдается прогрессирующее
снижение образования антител на стадии роста культуры во флаконах, то это
означает, что несекретирующие варианты гибридных клеток обогнали в росте
антителообразующие клетки. В таком случае важно отобрать
антителообразующие гибридные клетки путем клонирования, а небольшое
количество клеток из этих флаконов сохранить для последующих процедур'
клонирования. Клонирование клеток из тех флаконов, где а культуральной
среде выявляют прогрессивное снижение образования антител, почти всегда
безуспешно. Если все же очень важно выделить такую клеточную линию, то
следует извлечь из жидкого азота и разморозить образец клеток,
замороженный на самой ранней стадии культивирования и сразу же после
восстановления клеток в культуре провести клонирование. Клонирование
может быть осуществлено либо путем высевания небольшого количества клеток
в мягкий агар, либо с помощью лимитирующих разведений.
6.3. Клонирование клеток в полужидком агаре
Для этой процедуры клонирования необходимы следующие материалы:
1. Клетки гибридомы (3-105 клеток в 1 мл полной среды ГАТ).
2. Среда ГАТ, содержащая 50 мкМ 2-меркаптоэтанола. Держат в водяной бане
на 44 °С.
3. 3%-ный и 5%-ный растворы бактоагара, приготовленные на 0,9%-ном
растворе NaCl. Агар автоклавируют небольшими
Глава 3
Таблица 3.2. Процедура клонирования клеток в полужидком агаре
1. Расплавленный при 100 °С в сосуде с кипящей водой агар помещают В
водяную баню на 44-45 °С. При обращении с горячим агаром соблюдают
Осторожность.
2. Разбавляют 5%-ный агар средой ГАТ до конечной концентрации 0,5% (1 :
10), хорошо перемешивают и помещают в водяную баню на 44 °С. Удобно
одновременно готовить раствор агара на три чашки Петри (1,5 мл раствора
агара +13,5 мл среды).
3. Пипеткой наслаивают на дно 9 чашек Петри (диаметр 5 см) по 5 мл 0,5%-
ного агара. Дают агару застыть.
4. Разбавляя 3%-ный агар, готовят 9 аликвот по 5 мл 0,3%-ного раствора
агара в среде ГАТ и держат их в водяной бане на 44 °С.
5. Одну или две капли суспензии гибридомных клеток тщательно смешивают с
аликвотами 0,3%-ного агара, хорошо перемешивают и распределяют ровным
слоем по поверхности 0,5%-ного агара. Для каждой дозы гибридных клеток
готовят по три чашки.
6. Складывают чашки в чистый пластиковый сандвич-бокс, р, который
помещены чашки Петри, наполненные стерильной дистиллированной водой. Это
обеспечивает влажную атмосферу в боксе. Переносят бокс с негерметично
закрытой крышкой в С02-термостат с увлажнителем. Дают возможность воздуху
в боксе прийти в равновесное состояние с атмосферой термостата,
содержащей 5% С02, закрывают крышку бокса и оставляют на 10-14 дней.
7. На 10-14-й день с помощью пастеровских пипеток собирают колонии И
переносят их в лунки панели для микротитрования.
8. После образования монослоя тестируют супернатанты на содержание
антител. Одновременно удаляют всю среду и заменяют ее свежей средой ГАТ.
9. Отобранные положительные клоны наращивают сначала в панелях для
микротитрования, затем в лунках панели для культуры тканей объемом 2 мл
и, наконец, в небольших флаконах.
10. Замораживают для хранения в жидком азоте по меньшей мере 10 ампул с
образцами клеток клонированной линии.
порциями в стеклянных универсальных контейнерах и хранят при 4 °С;
4. Чашки Петри диаметром 5 см для работ с клеточными культурами.
Процедура клонирования описана в табл. 3.2.
6.4. Клонирование клеток методом лимитирующих разведений
Если гибридомные клетки выращивали в панелях для культуры тканей с
объемом лунок 2 мл (процедура гибридизации Б), а клонирование проводили в
мягком агаре, как описано выше, то в некоторых случаях необходимо было
проанализировать большое число колоний, прежде чем удалось обнаружить
антителообразующую колонию. По этой причине клонирование проводили в 96-
луночных плоскодонных планшетах для микротитрования с помощью
последовательных разведений клеточной взвеси. Преимущество такого подхода
заключается в том, что образование антител единичными колониями,
растущими в лун-
Предыдущая << 1 .. 53 54 55 56 57 58 < 59 > 60 61 62 63 64 65 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed