Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка):
клетки (по размеру и морфологии сходные с плазмацитомными) на фоне
сгруппированных клеток селезенки. На четвертый день, если гибридизация
прошла успешно, в некоторых лунках должны появиться небольшие колонии
гибридомы. К пятому дню, когда в лунки дополнительно добавляют среду, в
некоторых из них .должны выявляться большие колонии гибридом, которые на
.7-й день должны быть заметны уже в 20-100% от общего числа лунок. К
этому времени вы5кившие клетки селезенки образуют скопления, которые
могут интенсивно расти и угрожать выживанию медленно растущих гибридом.
Успешная процедура слияния требует не только хороших условий для слияния
клеток и обогащенной среды, стимулирующей рост, но и подавления роста
сохранивших жизнеспособность клеток селезенки. К последним могут
относиться макрофаги, фибро-бласты, предшественники тучных клеток 12] и
лимфоциты,
Моноклональные антитела мыши
129
которые образуют агломераты. Жизнеспособность этих клеток зависит от
состояния их активности в селезенке к моменту забоя животного (мыши).
Многие адъюванты повышают эту активность. Одна из причин добавления к
клеткам после слияния холодной, щелочной лошадиной сыворотки заключается
в том, что она, возможно, угнетает рост "фоновых" клеток, одновременно
.стимулируя рост клеток гибридомы. Конкуренция в росте важна только на
очень ранних стадиях. Как только гибридома стабилизировалась, ее
способность к размножению опережает таковую всех других типов клеток.
4.2. Методика Б
В данном случае также удобно провести два слияния в один день, используя
селезенки от двух мышей. Обычно мы ставим эксперименты по слиянию
последовательно - утром и ¦после полудня.
Непосредственно перед слиянием подготавливают следующие материалы н
оборудование,(в расчете на одно слияние).
1. Отбирают образец плазмацитомы, как описано в методике А, и помещают
107 жизнеспособных .клеток в универсальный контейнер. Оставляют при 37 °С
до приготовления суспензии селезеночных клеток.
2. Шесть флаконов, содержащих по 20 мл среды RPMI-1640. Помещают в
водяную баню или термостат на 37 °С.
3. ,Четыре флакона, содержащие по 24 мл среды RPMI-4640 с 20% СПК и
пенициллином/стрептомицином. Оставляют при 37 °С с плотно закрытыми
крышками, чтобы избежать защелачивания среды.
4. Два .Шприца на 10 мл с иглами № 23 (в каждом содержится по 10 мл среды
RPlMl-1640). Хранят в закрытой стерильной упаковке в ламинарном боксе.
5. Один шприц на 1 мл, содержащий 0,8 мл 50%-ного ПЭГ в среде RPMI-1640.
Хранят при 37 °С.
6. На столе: секундомер, 70%-ный этанол, фильтровальная бумага, пробирка
для уравновешивания с 21 мл воды, водяная баня на 37 °С, стерильные
инструменты, чащка Петри с 1 мл среды RPMI-1640.
7. В ламинарном бок'се: пипетки, чашка Петри.
.8. Две 24-луночные (объем лунки 2 мл) культуральные панели (Costar,
США). Они используются без предварительной подготовки.
4.2.1. Процедура гибридизации Б (основанная на одинарном слиянии]
Готовят суспензию клеток селезенки, как описано в методике А. Помещают
108 жизнеспособных клеток селезенки в
9-997
130
Глава 3
подходящий универсальный контейнер. Вынимают контейнер с клерками
плазмацитомы из термостата на 37 СС. Дважды отмывают клетки селезенки и
клетки 'плазмацитомы в отдельных контейнерах, используя предварительно
нагретую до 37 СС среду RPMI-1640. Центрифугируют при 200 g в течение 10
'мин и слегка встряхивают контейнеры, чтобы диспергировать осадок клеток,
образовавшийся во время отмывания. После двух отмываний ресуспендируют
клетки каждого типа в 10 мл теплой среды RPMI-1640. (Вливают суспензию
клеток селезенки в универсальный контейнер с клетками плазмацитомы и
тщательно перемешивают клетки, осторожно переворачивая контейнер.
Центрифугируют при 440 g в течение 10 мин. С помощью пастеровской пипетки
полностью удаляют супернатант, оставив только осадок клеток. Слегка
встряхивают контейнер, чтобы диспергировать клетки, а затем осуществляют
следующие процедуры.
1. Помещают контейнер в водяную баню на 37 °С, находящуюся в ламинарном
боксе, или в термостат и оставляют на 5 мин для достижения указанной
температуры.
2. Помещают, вынув из термостата, наполненный ,ПЭГ шприц в ламинарный
бокс. Вынимают контейнер из термостата на 37 °С и слегка /встряхивают для
перемешивания и распределения осадка клеток по коническому дну
контейнера.
3. Через 1 мин добавляют в контейнер 0,8 мл ПЭГ. Вращают контейнер в
наклонном положении, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток и
ПЭГ по коническому дну контейнера.
4. Оставляют контейнер на одну минуту при 37 °С в водяной бане или в
обычном термостате.
5. Через 1 мин добавляют по каплям 1 мл среды RPMI-1640, нагретой до 37
°С.
6. Через 5 мин медленно добавляют 20 мл теплой среды RPMI-1640.
7. Центрифугируют клетки ,при 440 g в течение 15 мин, используя для
уравновешивания пробирку с 21 мл воды.
8. Удаляют/супернатант и добавляют к осадку клеток 24 мл теплой среды
RPlMI-1640 с 20% СПК и антибиотиками. Закрывают контейнер крышкой, а
