Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 52

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 46 47 48 49 50 51 < 52 > 53 54 55 56 57 58 .. 122 >> Следующая

полученной суспензии отбирают 4 капли, добавляют 1 каплю 1%-ного
трипанового синего и подсчитывают количество живых клеток. Для каждого
отдельного эксперимента по слиянию центрифугируют по 107 жизнеспособных
клеток в круглодонных пробирках (из пирекса) на 30 мл с крышками при 500g
в течение 5 мин. Удаляют супернатант, ресуспендируют клетки в 20 мл среды
H-RPM1 - 2% СПК и оставляют при 4 °С.
2. Четыре шприца на 10 мл (каждый заполнен 10 мл H-RPMI - 2% СПК и
снабжен иглой № 26). Оставляют в закрытом стерильном боксе в ламинарном
шкафу.
3. Два шприца на 1 мл (каждый заполнен 0,7 мл 50%-ного раствора ПЭГ в 1
мМ NaOH). Оставляют в термостате на 37 °С.
4. Два универсальных контейнера, содержащие по 10 мл среды RPMI-1640.
Оставляют при 4 °С.
5. Два универсальных контейнера, содержащие по 20 мл среды RPMI-1640.
Оставляют при 37 °С. >
6. Щелочная среда RPM1-1640. Небольшое количество оставляют в закрытом
универсальном контейнере в ламинар' ном шкафу.
Моноклональные антитела мыши
125
7. Два флакона, содержащие по 30 мл полной среды ГАТ. Оставляют в
термостате на 37 °С.
8. На столе: секундомер, 70%-ный этанол, стерильные инструменты, водяная
баня на 37 °С, шприцы на 1 мл, иглы для шприца (№ 15), две чашки Петри,
содержащие по 1 мл H-RPMI -2% СПК.
9. В ламинарном боксе: две чашки Петри, пастеровские пипетки, пипетки.
10. 96-луночные панели для микротитрования. Их можно использовать без
предварительной подготовки. Однако мы лред'почитаем добавлять 1 каплю
смеси равных объемов лошадиной сыворотки и среды ГАТ в каждую лунку, а
затем оставляем панели на время процедуры гибридизации при 4 °С.
4.1.1. Процедура гибридизации ^
(основанная на парном слиянии]
На этой стадии кровь мышей предварительно уже была тестирована и анализ
сыворотки показал, что в ней содержится достаточное количество антител к
данному иммуногену.
1. Забивают мышь путем дислокации шейных позвонков и обмывают тушку 70%-
ным этанолом. Удаляют избыток спирта с помощью фильтровальной бумаги.
Помещают мышь на анатомический столик, предварительно обработанный 70%-
ным этанолом, и стерильными инструментами производят продольный разрез
брюшка, чтобы обнажить оелезейку. Извлекают селезенку с помощью
стерильных ножниц и пинцета, помещают ее в небольшое количество среды в
маленькой, стерильной чашке Петри и переносят в ламинарный бокс.
2. Обмыв селезенку средой, переносят ее в новую чашку Петри и приступают
к вымыванию лимфоидных клеток, используя шприцы на 10 мл с иглой № 26 (в
каждый шприц набирают по 10 мл H-RPMI - 2% СПК). Вымывание производят
следующим образом. При помощи одного шприца удерживают селезенку, затем
производят вымывание, последовательно прокалывая небольшие участки
селезенки и выпуская жидкость сначала из одного шприца, затем из другого.
3. Удаляют ка'псулу и строму селезенки из чашки Петри н переносят
суспензию клеток пастеровской пипеткой в пробирку на 30 мл, оставляя
маленькие кусочки ткани селезенки, которые могли осесть на дне чашки.
Пробирку оставляют в штативе в ламинарном боксе. Повторяют процедуру с
другой селезенкой.
4. Помещают по 4 капли каждой суспензии спленоцитов в лунки панели для
ми'кротитрования (нестерильной). Помещают предварительно подписанные
пробирки с суспензией спле-
126
Глава 3
ноцитов и пробирки с клетками плазмацитомы (извлеченные из холодильника
на 4 °С) в дентрифугу на 5 мин при 500 g. Тем временем добавляют по 1
капле 1%-ного трипанового синего в каждую лунку с суспензией клеток в
панели для мик-ротитрования, перемешивают пастеровской Пипеткой и
помещают каплю в камеру для подсчета клеток. Определяют количество
жизнеспособных лимфоцитов и лимфобластов. Общее .количество полученных
спленоцитов обычно составляет 0,6- 1,2-10s, из них жизнеспособных - около
90%. В большинстве экспериментов 108 клеток селезенки сливают с 107
клетками плазмацитомы.
5. По окончании центрифугирования вынимают пробирки из центрифуги и
осторожно сливают супернатант в стакан для отходов в стерильном
ламинарном боксе. Слегка встряхивают пробирки, чтобы диспергировать
осадок. Добавляют по 10 мл холодной среды RPMI-1640 в каждую пробирку с
клетками селезенки и переносят содержимое каждой пробирки в одну из
пробирок, содержащих клетки плазмацитомы. Осаждают клетки
центрифугированием при 400 g" в течение 7 мин, а в это время переносят
чистую водяную баню на 37 °С в стерильный ламинарный бокс. Полностью
удаляют супернатант пастеровской пипеткой. К осадку клеток добавляют 5
капель щелочной среды RPMI-1640. Пробирки слегка встряхивают, чтобы
диспергировать клетки.
6. Процедура гибридизации занимает 35 мин. Устанавливают секундомер на 35
мин. Последовательность операций описана в табл. 3.1. Все этапы,
описанные для пробирки № 1, повторяют с пробиркой № 2. (Начало работы
приходится на момент времени 29.00 в таблице для пробирки № 1). Когда
закончено центрифугирование пробирки № 1, ее переносят в ламинарный бокс
и центрифугируют приборку № 2, которая к этому времени должна быть
Предыдущая << 1 .. 46 47 48 49 50 51 < 52 > 53 54 55 56 57 58 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed