Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 53

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 47 48 49 50 51 52 < 53 > 54 55 56 57 58 59 .. 122 >> Следующая

готова.
7. Удаляют супернатант из пробирки № 1 и добавляют к осадку 30 мл теплой
среды ГАТ. Закрывают пробирку и переворачивают "ее, чтобы
ресуспендировать и диспергировать клеточный осадок. Подготавливают и
подписывают по 6 панелей для микротитрования на каждую из двух процедур
слияния. Используя пастеровскую пипетку, распределяют клетки (по одной
капле на лунку) во все 96 лунок каждой из 6 панелей. Когда все панели
заполнены, их ставят друг на друга и переносят в С02-термостат с
увлажненным воздухом. Повторяют те же процедуры с клетками, которые
используются для второго слияния.
На ранних стадиях культивирования, когда общий объем содержимого в лунке
составляет всего 0,07 мл, чрезвычайно ;важно, чтобы атмосфера термостата
была насыщена влагой
Моноклональные антитела мыши
127-
Таблица 3.1. Хронометраж процедуры слияния клеток
Время (мин)
Последовательность этапов
35.00-29.00
29.00-25.30 25.30
24.30-23.30
23.00
23.00-21.00
21.00-20.30
20.30-19.30
19.30-18.30
18.30-15.30
15.00-0.00
Распределяют клеточные осадки по стенкам пробирок путем-вращения нх в
горизонтальном положении (обе пробирки,, попеременно).
Помещают пробирку № 1 в баню на 37 °С, периодически вынимая, встряхивая и
вращая в горизонтальном положении. Вынимают шприц с ПЭГ нз термостата и
помещают его в-ламинарный бокс. Переносят среду RPMI-1640 (20 мл) в баню.
Вынимают пробирку № 1 из бани, встряхивают и вращают' в горизонтальном
положении.
Быстро добавляют ПЭГ (0,7 мл) в пробирку № 1.
Вращают пробирку № 1 в горизонтальном положении. Вся стенка пробирки
должна быть покрыта клетками.
Помещают пробирку № 1 в штатив в ламинарном боксе ю снимают крышку.
Помещают пробирку № 2 в баню на 37 °С. Пастеровскую пипетку, снабженную
резиновой грушей, опускают в пробирку, содержащую 20 мл теплой среды
RPMI-1640, находящуюся в бане.
Быстро добавляют приблизительно 1 мл теплой среды RPMI-1640 в пробирку №
1 и вращают ее в горизонтальном положении.
Быстро добавляют еще 1 мл теплой среды RPMI-1640 в пробирку № 1 и снова
вращают, перемешивая содержимое. Удаляют крышку с пробирки № 1, помещают
пробирку в баню и медленно добавляют оставшуюся часть среды RPMI-1640,
перемешивая содержимое пробирки, не вынимая.1 ее из бани.
Центрифугируют пробирку при 300 g в течение 15 мин (используя для
уравновешивания пробирку с 21 мл воды).
и поддерживался достаточный уровень СОг; в противном случае может
произойти испарение. На пятый день в каждую лунку добавляют по 0,15 мл
среды ГАТ с помощью многоканальной пипетки, снабженной стерильными
полиэтиленовыми наконечниками. Среду наливают в стерильную емкость
подходящего размера.
КоГда среда в большинстве лунок станет желтой (что обусловлено ростом
клеток, сопровождающимся выделением кислых продуктов метаболизма), то ее
полностью заменяют, с тем чтобы удалить "фоновые" антитела, образуемые
еще сохранившими жизнеспособность иммуноглобулин-секретиру-ющими клетками
селезенки. Это осуществляют следующим образом. Носик пастеровской пипетки
вытягивают в очень, тонкий капилляр, а затем кончик длиной около трех
сантиметров загибают под прямым углом. Вытянутые пи'петки стерилизуют
автоклавированием в алюминиевых контейнерах.
128
Глава 3
На дно контейнера помещают немного хлопковой ваты, чтобы избежать
повреждения кончиков пипеток. Пастеровские пипетки присоединяют к насосу,
полностью удаляют жидкость .из лунок и вносят в них по 0,2 мл среды ГАТ
(иногда вместе <с 5% лошадиной сыворотки), используя для этой цели
многоканальную пипетку. Таким образом обрабатывают все панели л снова
помещают их в термостат. Через 2 дня среда во многих лунках, как правило,
опять становится желтой. Как раз в .это время необходимо проверить
супернатанты на содержание антител. Можно тестировать отдельные лунки по
мере того, как среда в них желтеет, или подождать, пока это не произойдет
в большинстве лунок, и тогда протестировать сразу :все супернатанты.
Первая процедура, которой следует отдать предпочтение, если используется
трудоемкая система анализа, заключается в удалении почти всего
супернатанта с помощью ластеровской пипетки и переносе его в
пронумерованные панели для тестирования. Прежде чем приступить к
тестированию среды в следующей лунке, предыдущую следует заполнить свежей
средой. Чрезвычайно важно избегать переноса клеток из одной лунки в
другую. Пастеровскую пипетку можно простерилизовать с помощью кйпящей
воды, набираемой и вновь выпускаемой из пипетки, и охладить, набирая
холодную среду. Лишь затем эту пипетку используют для работы со следующей
лункой. Если применяют простую систему анализа .(например, реакцию
пассивной гемагглютинации), то проще и информативнее отбирать пробы со
всей панели, используя многоканальную пипетку. Технология скрининга
рассматривается в разд. 5.
Панели следует ежедневно просматривать под инвертированным микроскопом. В
течение первых двух дней, как правило, можно наблюдать лиВш отдельные
Предыдущая << 1 .. 47 48 49 50 51 52 < 53 > 54 55 56 57 58 59 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed