Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 55

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 49 50 51 52 53 54 < 55 > 56 57 58 59 60 61 .. 122 >> Следующая

затем, вращая его, ресуспендируют и диспергируют осадок клеток.
9. Подготавливают и надписывают две 24-луночные панели для культуры
тканей. Используя градуированную пипетку или диспенсер на 1 мл,
|снабженный стерильным наконечником, добавляют по 0,5 мл суспензии клеток
в каждую из 48 лунок.
10. Добавляют э каждую лунку по 1,5 мл теплой среды ,RPMI-1640 с 20% СПК
и антибиотиками. Переносят панели
Моноклональные антитела мыши
131
в термостат с регулируемым составом атмосферы и увлажнением.
День проведения .эксперимента по слиянию обозначают как нулевой день -
день 0. На Л, 2 и 0-й день после слияния осторожно заменяют по 1 мл среды
из каждой лунки на 1 мл среды ГАТ. Важно не потревожить клетки в лунках,
в частности, избежать перемещения клеток на одну сторону лунки при
добавлении свежей среды. Это существенно по двум причинам. Во-первых, в
результате обеспечивается возможность спокойного (без активации) роста
"фоновых" клеток, что способствует росту гибридом. Во-вторых, на более
поздних стадиях можно видеть, происходит ли в лунке рост одной или
нескольких колоний гибридных клеток.
Кроме того, чрезвычайно важно избежать перекрестного переноса клеток из
одних лунок в другие. Для удаления среды из каждой лунки мы используем
диспенсер на 1 мл, снабженный новым наконечником одноразового
использования. Когда в лунках происходит интенсивный рост гибридомных
клеток, то смена наконечников для каждой лунки гарантирует та!кже, что в
супернатанты, взятые для анализа, не будут занесены антитела из других
лунок. Добавление свежой среды ко всем лункам (по 1 мл) можно производить
одним наконечником при условии, что не происходит контакта наконечника со
средой в лунках. После смены культуральной среды на 1, 2 и 3-й день после
гибридизации вполне достаточно и удобно заменять 1 мл среды на 1 мл
свежей среды ГАТ по понедельникам, средам и пятницам. Благодаря смене
среды каждые 2-3 дня фоновые антитела, синтезированные сохранившими
жизнеспособность клетками селезенки, удаляются.
Перед сменой среды панели с клетками следует просмотреть род микроскопом.
Морфология культур описана в методике А. Если клетки не повреждаются во
время смены среды, то начавшие расти гибридомы должны образовать
достаточно обособленные колонии. Если рост колоний наблюдается в большей
части лунок, то необходимо подсчитать число индивидуальных колоний в
каждой лунке. Если лунка содержит более одной колонии, то, проводя
скрининг, следует, не откладывая, отбирать и клонировать линии гибридных
клеток. В целом гибридомы, растущие в панелях Costar, должны быть
клонированы как можно раньше, поскольку в данном случае -(в отличие от
того, когда иСпользуют панели для микротит-рования) в лунках образуется
более одной колонии. Полезно руководствоваться следующим соображением:
если в '/з лунок или менее наблюдается рост клеток, то в большинстве
случаев в лунках представлен рост клонов.
е*
132
Глава 3
Обычно между 18-м и ,25-м днями супернатанты исследуют на антительную
активность. К этому времени гибридомные клетки практически образуют
монослой и среда имеет выра-жен'ную желтую окраску. Это гарантирует, что
супернатант содержит оптимальное количество антител для скрининга.
Скрининг супернатантов из всех 48 лунок, включая и лунки, где не
наблюдается роста, имеет то преимущество, .что позволяет провести
положительный отбор на фоне остаточных антител. Чтобы определить,
возрастает или снижается продукция антител данной отдельной культурой,
целесообразно проводить последовательное тестирование содержания антител
в супернатантах, отбираемых через каждые 2-3 дня. Снижение уровня антител
может быть связано как с проблемой остаточного фонового роста в данной
лунке, так и с повышенной ростовой активностью несекретирующих гибридных
клеток по сравнению с линией гибридомы. Трудно спасти антителосёкре-
тирующие гибридомы из .лунок, где в супернатантах выявляется
прогрессивное снижение продукции антител. Кроме того, целесообразно
попытаться клонировать отдельные клетки, но это не всегда приводит к
желаемому результату.
4.3. Замечания к различным стадиям процедуры гибридизации
1. Важно, чтобы .плазмацитома находилась в логарифмической фазе роста.
Нельзя допускать полного использования клетками культуральной среды. За
день до слияния желательно сменить среду. Если есть опасения, что ко дню
слияния клетки могут перерасти, то можно приготовить два или три флакона
с клетками плазмацитомы в различной концентрации. Б этом случае вы можете
выбрать для ^слияния наиболее подходящую культуру. Жизнеспособность
клеток, о которой судят по Исключению красителя, должна быть высокой.
Клеточные суспензии обычно готовят непосредственно перед слиянием, но
клетки Ажно оставить на два часа в H-RPMI - 2% СПК лри 4 °С.
2. Спленоциты лучше получать, вымывая их из селезенки, чем измельчая или
раздавливая орган в гомогенизаторе. В .первом случае получают ,чистые
однородные суспензии с высо-кой жизнеспособностью .клеток. Клетки
Предыдущая << 1 .. 49 50 51 52 53 54 < 55 > 56 57 58 59 60 61 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed