Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 49

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 43 44 45 46 47 48 < 49 > 50 51 52 53 54 55 .. 122 >> Следующая

или крыс (Lou). Если предполагается выращивать гибридомы в виде асцитных
опухолей, то понадобится довольно большое количество животных.
2.1. Материалы
2.1.1. Линии плазмацитом
Используемые для получения гибридом 'плазмацитомные клеточные линии
дефектны по ферменту гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазе (ГГФРТ) и
отбираются на среде,
118
Глава 3
содержащей тиогуанин (2-10-5 М). Это означает, что клетки, дефектные по
ТТФРТ, не Способны к синтезу ДНК, если их культивировать в среде с
ги'поксантином, аминоптерином и ти-мидином (среда ГАТ). В результате
слияния с родительскими лимфоцитами этот дефект устраняется. Таким
образом, только гибридные клетки способны расти на среде ГАТ.
Линии 'плазмацитом обычно культивируют в стандартной неразбавленной среде
RPMI-1640 с добавлением L-глутамина (Gibco Bio-cult, США), 10% сыворотки
плода коровы (СПК), антибиотиков - пенициллина (100 Ед/мл) и
стрептомицина (100 мкг/мл), а также тиогуанинп (20 мМ). В продажу
поступает коммерческий "препарат (Gibco Bio-cult, США) исходного
стократного (ЮОХ) раствора пенициллина и стрептомицина в нужной
концентрации. Среду дополняют тиогуанином для удаления ревертантных
клеток, содержащих "нормальный" уровень ГГФРТ, которые, подобно
гибридным, выживают в среде ГАТ.
1. Готовят ЮОХ раствор тиогуанина (2 мМ) следующим образом. Растворяют
33,44 мг безводного тиогуанина в 100 мл дистиллированной воды. Добавляют
1 М NaOH, если необходимо, для растворения тиогуанина и доводят pH до 9,5
уксусной кислотой. Фильтруют раствор через мембраны Miilipore <(размер
пор 0,2 мкм), разливают на алйквоты и хранят при
I-20 °С.
2. Для приготовления поддерживающей среды для плазма-цитомы смешивают
следующие растворы:
500 мл среды RPMI-1640, содержащей L-глутамин;
50 мл инактивированной нагреванием СПК '(конечная концентрация-9%);
5.5 мл исходного раствора пенициллин/стрептомицин;
5.5 мл стандартного исходного раствора тиогуанина.
ГАТ-чувствительная плазмацитома, полученная от мышей
линии BALB/c, P3-NSI/Ag4-l (как правило, обозначаемая NSI), представляет
собой вариант линии МОРС21, не секре-тирующий иммуноглобулинов [4]. Она
хорошо1 растет in vitro на среде RPMI-1640 с добавлением 10% СПК, а также
при внутрибрюшинном введении мышам BALB/c. Эта плазмацитома синтезирует,
но не секретирует легкие цепи иммуноглобулинов. ГАТ-чувствительная
плазмацитома X63/Ag8.653, полученная от мышей линии BALB/c, представляет
собой вариант линии X63/Ag8; она не синтезирует ни тяжелых, ни легких
цепей иммуноглобулинов [4]. Клетки обеих линий хорошо сливаются, но
гибридомы, образованные с помощью NSI, растут несколько лучше.
Моноклональные антитела мыши
119
2.1.2. Реагенты, используемые для слияния
В ранних работах таким реагентом обычно служил инактивированный
ультрафиолетом вирус Сендай. К настоящему времени его заменил
полиэтиленгликоль (ПЭГ), который обычно применяют в виде 50%-ного (вес на
объем) раствора. 50%-ный раствор ПЭГа целесообразно готовить на воде, а
не на обычной культуральной среде, поскольку в этой концентрации он
гипертоничен. ПЭГ - это слабая кислота; для ее нейтрализации достаточно 1
мМ NaOH.
1. Отвешивают 8 г ПЭГа 1500 в универсальный стеклянный флакон.
2. Готовят 1 мМ раствор NaOH в дистиллированной воде и добавляют к нему
одну каплю фенолового красного (изменение окраски от красной до
пурпурной). Добавляют 8 мл этого раствора к ПЭГ и оставляют при 37 °С для
растворения.
3. Стерилизуют автоклавированием в негерметично закрытом сосуде и
проверяют уровень жидкости по маркировке на флаконе. Если уровень
раствора ниже отметки, доводят объем до первоначального с помощью
стерильного раствора 1 мМ NaOH.
4. Остужают, разливают на аликвоты 'по 3 мл в стерильные ампулы и хранят
при 4 СС.
2.1.3. Среда ГАТ
Эту среду обычно используют для селекции и культивирования гибридных
клеток; она состоит из неразбавленной стандартной среды RPMI-1640, в
которую добавлен L-глутамин, 20% СПК, пенициллин (100 Ед/мл),
стрептомицин (100мкг/мл), 100 мкМ гипоксантина, 16 мкМ тимидина и 0,5 мкМ
метотрексата.
Готовят следующие исходные растворы.
1. Гтоксантин и тимидин. Готовят 100Х исходный раствор, содержащий 10 мМ
гипоксантина и 1,6 мМ тимидина. Растворяют 408 мг гипоксантина в 10 мл
дистиллированной воды при 'постоянном перемешивании и добавляют 1 М NaOH
по каплям до растворения гипоксантина. Растворяют 114 мг тимиди-¦на в 100
мл дистиллированной воды. Смешивают оба раствора и доводят объем до 300
мл дистиллированной водой. Доводят pH до 10,0 с помощью НС1 или NaOH,
стерилизуют фильтрованием через мембраны Millipore, разливают на аликвоты
и хранят при -20 °С.
2. Аминоптерин (метотрексат). Аминоптерин (100Х исходный раствор с
концентрацией 50 мкМ) готовят из ампулиро-ванного лекарственного средства
метотрексата. Ампулы со-
120
Глава 3
держат по 2 мл раствора с концентрацией 25 мг/мл. При извлечении
препарата из ампул следует соблюдать осторожность, поскольку метотрексат
Предыдущая << 1 .. 43 44 45 46 47 48 < 49 > 50 51 52 53 54 55 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed