Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 50

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 44 45 46 47 48 49 < 50 > 51 52 53 54 55 56 .. 122 >> Следующая

токсичен. Разводят 0,9 мл раствора метотрексата в 1 л дистиллированной
воды и доводят pH до 7,5 с помощью 0,01 М NaOH или 0,01 М НС1.
Стерилизуют фильтрованием через мембраны Miilipore, разливают на аликвоты
и хранят при -20 °С.
3. 2-Меркаптоэтанол. 2-Меркаптоэтанол в концентрации 50 мкМ может быть
добавлен к среде ГАТ в качестве агента, способствующего росту гибридных
клеток. Кроме того, его следует обязательно добавлять при клонировании
гибридных клеток. Для приготовления среды с 2-меркаптоэтанолом к 10 мл
стандартной среды RPMI-1640 добавляют 0,06 мл препарата. Стерилизуют
фильтрованием, разливают на аликвоты и хранят при -20 °С.
Для приготовления полной среды ГАТ необходимо смешать следующие
стандартные растворы:
500 мл среды RPMI-1640 с L-глутамином;
100 мл инактивированной нагреванием СПК (концентрация СПК приблизительно
16%);
6 мл исходного раствора пенициллин/стрептомицин;
6 мл исходного раствора гипоксантин/тимидин;
6 мл стандартного раствора метотрексата;
12 капель (0,36 мл) 2-меркаптоэтанола добавляют пастеровской пипеткой,
как указано выше.
2.1.4. Среда Дюльбекко
Среду Дюльбекко готовят из готового сухого концентрата '(Gibco Bio-cult,
США) и используют вместо среды RPMI-1640 или в комбинации с ней. Так
называемые щелочные среды Дюльбекко или RPMI-1640, обычно используемые на
стадии слияния, - это среды, которые предварительно защелачивают в
универсальных контейнерах путем равновесного взаимодействия с атмосферным
воздухом. Этого очень легко достигнуть, если за несколько дней до
использования крышку на флаконе закрыть неплотно.
2.1.5. Сыворотки
Обычно используют сыворотку плода коровы (СПК), предварительно
инактивированную нагреванием в водяной бане при 56 °С в течение 30 мин.
Различные партии СПК значительно варьируют по способности поддерживать
рост культур, поэтому чрезвычайно важно выбрать хорошую партию. Самый
простой и надежный способ определения качества сы-
Моноклональные антитела мыши
121
воротки заключается в клонировании гибридомы методом лимитирующих
разведений (см. разд. 6.4) в среде, содержащей образцы анализируемой
сыворотки. Дополнительное введение в среду для инкубации лошадиной
сыворотки (5%) часто оказывает положительный эффект, если СПК невысокого
качества. Рекомендовано и применение сыворотки крови человека [7].
Разумеется, нельзя использовать сыворотку, содержащую антиген, к которому
направлены получаемые моноклональные антитела (например, иммуноглобулин
человека или других видов, с которыми наблюдаются перекрестные реакции, в
том случае, когда требуется по'лучить моноклональные антитела к
иммуноглобулину).
2.1.6. Среда RPMI с буфером Hepes (H-RPMI)
Это среда RPMI-1640, которая забуферена Hepes (N-2-гидроксиэтилпиперазин-
Л?'-2-этансульфоновая кислота) в концентрации 4,6 г/л вместо обычного
бикарбоната натрия. В среду Н-RPMI добавляют 2% СПК (H-RPMI - 2% СПК). В
результате получают идеальный реагент для промывания и суспендирования
клеток при работе с ними вне термостата, так как он сохраняет стабильное
значение pH при атмосферных условиях. Но в качестве ростовой среды H-RPMI
- 2% СПК непригодна.
3. Иммунизация мышей
Могут быть использованы животные в возрасте 3-4 мее любого пола.
Используемая схема иммунизации зависит от природы иммуногена в такой же
степени, как и при получении поликлональной антисы'воротки. Важно
установить, что у мышей, клетки которых предполагается ис'пользовать в
экспериментах по слиянию, в ответ на введение данного иммуногена
образуются антитела. Забор крови для контрольного исследования производят
из хвостовой вены спустя неделю после заключительной иммунизации. Если в
сыворотке обнаруживают антитела в адекватном титре, то за 3-4 дня до
извлечения селезенки для слияния клеток производят последнее введение
иммуногена. Иногда трудно интерпретировать результаты тестирования крови,
поскольку сыворотка содержит сло'жную смесь антител. Неоднозначно, что
все данные антитела были образованы секретирующими клетками селезенки, а
также, что именно эти антиген-реактивные клетки будут преимущественно
синтезировать Ig в ходе иммунного ответа
122
Глава 3
на повторное введение антигена. Однако тестирование крови животного
указывает на образование или отсутствие нужных антител.
3.1. Иммунизация антигенами клеточной поверхности (и другими
корпускулярными антигенами)
Для антигенов клеточной поверхности может быть использована следующая
схема иммунизации. Выбор процедуры может определяться количеством клеток,
доступных для иммунизации.
1. Иногда достаточно двух внутрибрюшинных (в/б) инъекций 107 целых клеток
в PBS, произведенных соответственно за 4 нед и за 3-4 дня до процедуры
гибридизации.
2. Авторы предпочитают соблюдать следующую схему: за 3-4 нед до
гибридизации внутрибрюшинно вводят первичную дозу (107 целых клеток), а
затем проводят последующие иммунизации за 7 и за 3 дня до слияния. За
неделю до второго введения иммуногена кровь мышей тестируют.
Предыдущая << 1 .. 44 45 46 47 48 49 < 50 > 51 52 53 54 55 56 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed