Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 51

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 45 46 47 48 49 50 < 51 > 52 53 54 55 56 57 .. 122 >> Следующая

3. Альтернативный подход заключается в иммунизации мышей внутрибрюшинно
суспензией клеток в PBS (разовая доза составляет 107 клеток) на 0, 14 и
21-й день. Спустя семь дней тестируют кровь, и животным с высоким уровнем
антител внутривенно (в/в) вводят по 107 клеток за три дня до слияния.
4. В том случае, когда мышей иммунизируют клетками человека, наблюдается
выраженный ответ на видоспецифические антигены. Для того чтобы направить
иммунный ответ мышей на антигены, селективно экспрессированные на
поверхности определенных клеток, может быть использован метод
"маскировки" антителами. Например, он был успешно использован при
по'лучении моноклональных антител, специфичных к антигенам, избирательно
экспрессированным на клетках миелоидного ряда человека. Клетки
миелоидного ряда, которыми иммунизировали мышей для экспериментов по
гибридизации, были нагружены мышиными антителами к лейкоцитам
периферической крови человека [8]. Смысл данного подхода заключается в
том, что, нагружая клетки, удается "замаскировать" иммуногенные
поверхностные белки, экспрессируемые клетками человека.
Введенный в/б или в/в антиген достигает слезенки, и с этого момента
данный орган обычно становится источником ан-титело-продуцирующих клеток,
которые используются в экспериментах по слиянию. В ряде случаев
непосредственно перед слиянием антиген вводится в/в, что может вызвать
анафилактический шок. Если же необходимость в проведении в/в инъекции
сохраняется, то для избежания возможного раз-
Моноклональные антитела мыши
123
вития шока рекомендуется провести за несколько часов до этой инъекции в/б
инъекцию (например, в/б утром и в/в в полдень) .
3.2. Иммунизация растворимыми антигенами
Для растворимых антигенов известны разнообразные схемы иммунизации.
Например, первую инъекцию 100 мкг антигена, эмульгированного в полном или
неполном адъюванте Фрейнда, осуществляют подкожно (в 0,1 мл), а
последующие инъекции (цо 100 мкг в PBS объемом 0,5 мл) проводят в/б с
интервалом в месяц. Отбирают пробу крови, чтобы убедиться в наличии
адекватного титра антител в сыворотке, а затем осуществляют последние
инъекции антигена (в/б утром и в/в днем), за 3-4 дня до гибридизации.
Некоторые исследователи предпочитают избегать применения адъюванта
Фрейнда. Действительно, он может стимулировать развитие гранулом, клетки
которых повышают фоновый рост в культурах после гибридизации.
Предпочтительнее использовать адсорбированный на квасцах антиген в смеси
с убитыми клетками Bordetella pertussis в качестве адъюванта [9]. Другой
способ, который был успешно применен в случае иммуноглобулинов,
заключается в связывании антигена с частичками пластика [10] с
последующим осуществлением иммунизации в/б, без адъюванта. Относительно
небольшие пептиды иногда необходимо конъюгировать с белком-носителем, но
они могут приобрести иммуногенность при введении в полный адъювант
Фрейнда.
4. Методика гибридизации
Известны различные модификации оригинального метода Келера и Мильштейна
[1]. Популярны методики Галфре [11] и Кеннета [5], однако практически
каждый научный центр ¦стремится развивать свою собственную методику,
которой отдает предпочтение.
Перед тем как рассмотреть некоторые наиболее существенные модификации, мы
остановимся на двух основных методиках гибридизации, которые используются
одинаково успешно. Они иллюстрируют возможность широких вариаций при
осуществлении различных стадий метода без снижения эффективности
гибридизации. В частности, в первом случае клетки после слияния
культивируют в 96-луночной панели для микротитрования. Во втором случае
гибридомы выращивают в 24-луноч-Н1ых панелях для культуры тканей (объем
лун'ки 2 мл). В данном случае выбор панели может быть обусловлен как
удоб-
124
Глава 3
ством манипуляций при работе с клетками, так и определенными навыками в
работе с культурой ткани и имеющимся в распоряжении оснащением.
Успех экспериментов по гибридизации будет зависеть от тщательного и
адекватного манипулирования с клетками во время процесса слияния (см.
разд. 4.3). Если первая попытка оказалась неудачной, то необходимо
повторить эксперимент, следуя выбранной вами вначале методике. Опыт,
полученный в результате первой попытки, гарантирует, что при второй вы
¦проведете эксперимент более тщательно. Если же у вас по-прежнему
возникают проблемы при культивировании гибридных клеток, то следует
прибегнуть ко второй методике. Таким образом можно избежать ошибки, о
которой вы не подозреваете (см. разд. 4.3).
4.1. Методика А
Удобно и целесообразно ставить параллельно два эксперимента по слиянию,
используя селезенки от двух мышей. Перед процедурой слияния следует
подготовить следующие материалы:
1. Отбирают образец плазмацитомной линии путем ресуспендирования клеток,
растущих в среде с тиогуанином. В случае линии NSI при встряхивании
флакона клетки ресуспенди-руются плохо, поэтому их переводят в суспензию,
обмывая монослой средой, вытекающей из пастеровской пипетки. Из
Предыдущая << 1 .. 45 46 47 48 49 50 < 51 > 52 53 54 55 56 57 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed