Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 58

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 52 53 54 55 56 57 < 58 > 59 60 61 62 63 64 .. 122 >> Следующая

отмывают избыток антител и добавляют анти-глобулиновый реагент к
иммуноглобулинам мыши, конъюгированный с ферментом или радиоактивным
иодом. Инкубацию продолжают в течение часа, затем вновь осуществляют
процедуру отмывания и в зависимости от выбранного теста либо выявляют
ферментативную активность (ELISA), либо измеряют уровень радиоактивности
в лунках (РИА). Эти процедуры детально описаны в кн. 2.
В реакции пассивной гемагглютинации эритроциты нагружают антигеном с
помощью хлорного хрома. Такие эритроциты хранят в стерильных условиях до
употребления [15]. Реакция,, подробно описанная в гл. 7, заключается в
следующем. Добавляют одну каплю супернатанта к одной капле 0,5%-ной
суспензии нагруженных антигеном эритроцитов барана. Оставляют в течение
1-2 ч при комнатной температуре, а затем оценивают результаты.
Если следуют процедуре гибридизации А и гибридомные клетки растут в
лунках панели для микротитрования, то забор образцов для тестирования
одновременно со всех панелей можно осуществлять с помощью многоканальной
пипетки. Отобранные пробы переносят непосредственно в панель для
микротитрования с круглодонными лунками. Когда все панели с пробами
полностью укомплектованы, в каждую лунку добавляют по одной капле 0,5%-
ной суспензии нагруженных антигеном эритроцитов барана. Конкурирующий
агент может быть добавлен в буфер для разведения с целью проверки
специфичности моноклональных антител. Например, если нужно отобрать
моноклональные антитела к IgG2 человека, то используют эритроциты барана,
нагруженные IgG2, a IgGi добавляют к буферу для разведения. В этом случае
только те МКА, которые специфически распознают IgG2, будут
агглютинировать нагруженные антигеном эритроциты барана, а МКА, которые
связываются и с IGg2, и с IgGi, в основном взаимодействуют с избытком
IgGi в буфере для разведения. Нужные клоны выращивают в культуре, как
описано в разд. 6.
6. Клонирование линий гибридомных клеток
Моноклональность антител обеспечивается клонированием гибридом.
Осуществляют ли клонирование непосредственно после слияния или же на
более поздней стадии, в некоторой степени зависит от того, выращивались
ли первичные гибридомные культуры в лунках панели для микротитрования
(процедура гибридизации А) или в объеме 2 мл в лунках 24-х луночной,
панели для культуры тканей (процедура гибридизации Б).
138
Глава 3
6.1. Процедура гибридизации А
Если клетки после слияния рассевают в лунки панели для микротитрования,
то гибридомы, продуцирующие антитела нужной специфичности, затем
пересаживают в 24 луночные панели для культуры тканей с объемом лунок 2
мл. Далее при образовании монослоя и окрашивания среды в желтый цвет,
супернатант можно повторно тестировать, используя определенный набор
антигенов. Если результаты тестирования удовлетворительные, то гибридому
наращивают в нескольких лунках, затем в универсальных контейнерах и далее
во флаконах постепенно возрастающего объема. К этому времени обычно уже
происходит самопроизвольное клонирование клеток. Тот клон, который
отличается наилучшим ростом (предполагаемый источник антител), постепенно
получает преимущество над всеми другими в культуре.
Клонирование лучше всего проводить или на ранней стадии, чтобы не
допустить вытеснения медленно растущего клона клетками быстрорастущих
соседних клонов, или на конечной стадии, когда получена стабильная линия
антителообразующих клеток. В последнем случае клонирование, как правило,
лишь формально подтверждает моноклональность. Если до стадии продукции
антител клонирования не проводили, то его необходимо осуществить позднее,
в том числе и с уже клонированными линиями. Цель такого подхода -
удаление непродуцирующих антитела клонов, которые иногда образуются после
длительного культивирования. Если данные клоны не отделить в процессе
последующего клонирования, то они могут постепенно вытеснить другие
антителообразующие клоны. Некоторые линии чрезвычайно стабильны и не
требуют повторного клонирования. У других гибридомных линий изменяются
ростовые характеристики и антителообразующая активность. В этом случае
иногда целесообразно повторное клонирование, но некоторым линиям
свойственна нестабильность. Поэтому сразу после клонирования линии клеток
следует немедленно заморозить (по меньшей мере 10 ампул) в жидком азоте.
Ими можно будет воспользоваться, если клонированная линия окажется
нестабильной при дальнейшем культивировании.
Чем эффективнее гибридизация, тем больше вероятность, что в каждой лунке
вырастет более одного клона и что два клона со сходными темпами роста
будут сосуществовать в одной лунке. Наличие двух и более клонов можно
выявить по обнаружению в супернатанте антител более чем одной
специфичности и более чем одного класса и подкласса, а также с помощью
изоэлектрофокусирования (сложный спектр анализируемых антител). При
получении соответствующего результата необходимо безотлагательное
клонирование.
Моноклональные антитела мыши
Предыдущая << 1 .. 52 53 54 55 56 57 < 58 > 59 60 61 62 63 64 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed