Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 62

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 56 57 58 59 60 61 < 62 > 63 64 65 66 67 68 .. 122 >> Следующая

росли до такой степени, чтобы возникла угроза снижения их
жизнеспособности и наступила гибель клеток. Культуры гибридных клеток,
содержащие высокий процент нежизнеспособных клеток, часто трудно
восстановимы и их приходится выбрасывать. Культуральную жидкость собирают
и затем центрифугируют при 500 g в течение 5 мин для удаления клеток.
Культуральную жидкость, собранную из нескольких флаконов с одной
гибридомной линией и полностью освобожденную от клеток, сливают в чистые
стеклянные бутыли. Чтобы запасти достаточное количество культуральной
жидкости для собственных нужд и снабдить им других исследователей, авторы
рекомендуют приготовить 500 мл культуральной жидкости, содержащей 0,1%
азида натрия. Так, ее можно хранить при 4°С. Большинство антител в такой
культуральной жидкости стабильно. Контролируя содержание антител ее можно
использовать в течение нескольких лет.
7.2. Асцитная жидкость, полученная в результате интраперитонеальной
инъекции гибридных клеток мышам
1. За 1-3 нед до инъекции клеток гибридомы, выращенных в культуре, мышам
линии BALB/c, в возрасте 3-4 мес, проводят интраперитонеальную инъекцию
0,5 мл пристана (2,6,10,14-тетраметилпентадекана; Koch-Light,
Великобритания).
2. Каждой мыши вводят по меньшей мере 106, а желательно по 107 клеток в
PBS. Гибридома растет в виде асцитной опухоли, и асцитная жидкость
содержит антитела в концентрации, приблизительно в 10-500 раз превышающей
таковую в культуральной жидкости (концентрация антител в асцитной
жидкости составляет несколько мг в 1 мл).
3. Для того чтобы собрать асцитную жидкость, мышь забивают дислокацией
шейных позвонков. Делают надрез таким образом, чтобы обеспечить доступ в
перитонеальную полость, и дренируют ее пастеровской пипеткой, отбирая
асцитную жидкость.
4. Центрифугируют асцитную жидкость (при высоком числе оборотов в минуту)
для удаления клеток и клеточного дебриса. Супернатант лучше всего хранить
при -20 °С, разлив на али-
/
146 Глава 3
/
квоты по 1 мл, либо в большом объеме, если антител^ будут подвергать
дальнейшей очистке. ¦'
Разумеется, асцитная жидкость загрязнена другими иммуноглобулинами мыши.
Содержание примесей зависит от чистоты содержания животных.
Предпочтительно использовать мышей, свободных от видоспецифических
патогенных возбудителей, если таковые доступны. Степень загрязнения
антител увеличивается и при значительном излиянии крови в асцитную
жидкость. Некоторые гибридомы хорошо растут в брюшной полости. Другие же
линии, образующие достаточное количество антител в культуре, in vivo
продуцируют мало антител, несмотря на хороший рост в виде асцитных
опухолей. Некоторые гибридомы формируют солидные опухоли или метастазы.
Иногда, ¦еще не достигнув значительного роста, такие опухоли служат
причиной гибели хозяина-носителя.
8. Контроль качества: клеточные линии и препараты антител
Первостепенное значение для осуществления контроля качества имеет
создание запаса замороженных гибридомных клеточных линий с указанием даты
заморозки. Следует замораживать образцы культивируемых клеток на каждой
фазе роста. Образцы асцитных жидкостей следует замораживать с
обозначением номера каждого пассажа.
8.1. Замораживание клеток
Ниже представлена простая и эффективная технология замораживания.
1. Используют клетки хорошо делящейся, здоровой культуры. Центрифугируют
в специальном контейнере приблизительно по 107 клеток на каждую ампулу,
которая будет заморожена.
2. Удаляют супернатант и ресуспендируют клетки (в концентрации 1 -107
клеток в 1 мл) в 1 мл холодной СПК, содержащей 5 % диметилсульфоксида.
Смесь для замораживания следует приготовить заранее и хранить при -20°С,
разлив на аликвоты.
3. Переносят суспензию клеток в маленькие полипропиленовые ампулы,
которые подписывают, используя несмываемый карандаш, с указанием кода
замораживаемой линии и даты.
4. Помещают замораживаемые ампулы в большую коробку из полистирола с
толщиной стенок приблизительно 2-3 см, снабженную крышкой. Коробку
переносят в морозильник на -20 °С и оставляют на 30 мин. Подходящими для
заморажи-
\
д
Моноклональные антитела мыши
147
вания контейнерами служат маленькие коробки, в которых лабора+ории
получают легкобьющиеся материалы. Объемные полистироловые контейнеры
обеспечивают медленное охлаждение ампул с клетками (идеально 1 °С в мин)
до температуры -20 "С.
5. Спустя 30 мин переносят коробку в морозильник на -70 °С и оставляют
либо на 6 ч, либо на ночь. Затем ампулы переносят в контейнер с жидким
азотом для хранения.
Согласно альтернативной методике замораживания, полипропиленовые пробирки
переносят в 50%-ный глицерин, охлажденный до -32 °С. Спустя 40 мин
пробирки извлекают, протирают тканью и переносят непосредственно в
контейнер с жидким азотом.
8.2. Размораживание клеток
1. Чтобы восстановить культуру, нужно быстро разморозить пробирки, держа
их в струе горячей воды из крана и легко покачивая до тех пор, пока лед в
пробирке почти не исчезнет.
Предыдущая << 1 .. 56 57 58 59 60 61 < 62 > 63 64 65 66 67 68 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed