Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 20

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 14 15 16 17 18 19 < 20 > 21 22 23 24 25 26 .. 122 >> Следующая

веществ в пробирке. Преципитации способствует добавление 3%-ного (вес на
объем) раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) (мол. масса 6000, см.
приложение). Рекомендуется использовать очищенный IgG, чтобы избежать
включения в состав комплекса компонентов комплемента. Реакцию лучше
проводить в небольших препи-литационных пробирках с одним и тем же
количеством анти-
Получение поликлональных антител и контроль их качества
51
тел и различными концентрациями иммуногена, который добавляют в
эквивалентном объеме PBS (0,01 М, pH 7,4) с 6% ПЭГ. После инкубации в
течение 1 ч при 37 °С и в течение ночи при 4°С происходит видимая на глаз
преципитация в средней части слоя. Для иммунизации используют преципитат
из той пробирки, где содержался небольшой избыток антигена,
центрифугируют (10 ООО g, 1 ч) и трижды промывают 3%-ным раствором ПЭГ в
PBS. Затем преципитат суспендируют в небольшом объеме PBS и вводят в ПАФ
для инъекции (см. разд. 4). В тех случаях, когда антисыворотка
принадлежит другому виду животных, при иммунизации, помимо ответа на
антиген, образуются антитела к гетерологичным Ig. Антиглобулины, однако,
легко удалить абсорбцией (см. разд. 9).
Преципитация иммунных комплексов из сыворотки с помощью ПЭГ необходима в
том случае, когда подразумевается, что антиген для иммунизации
циркулирует в крови в виде растворимых иммунных комплексов. Равные объемы
сыворотки и 4%-ного ПЭГ смешивают и инкубируют 1 ч при 4°С, затем
центрифугируют (10 ООО g, 1 ч, 4°С), дважды отмывают преципитат 2%-ным
ПЭГ в PBS, осадок ресуспендируют в PBS и используют в комплексе с ПАФ.
II. Линии и пики преципитации в гелях. Преципитат, полученный в геле,
после отмывания и гомогенизации может быть использован для иммунизации.
При этом легко и быстро получить моноспецифические антитела, не прибегая
к помощи трудоемких и требующих особых навыков методов выделения
иммуногена. При проведении двумерного иммуноэлектрофореза (см. гл. 6)
сложную смесь антигенов предварительно разделяют в одном направлении, а
затем в другом (перпендикулярном первому) в слое агарозного геля,
содержащего соответствующие антитела. Участки геля, где пики не
перекрываются, можно аккуратно вырезать и использовать как очищенный
комплекс для иммунизации. Данный метод применим к любому антигену,
который мигрирует к аноду при pH 8,6 и содержится в исходной смеси в
концентрации более 10- 20 мкг/мл, т. е. способен образовать видимый пик.
Пример подобного подхода приведен на рис. 2.2. Для получения
удовлетворительных результатов мы рекомендуем использовать следующую
методику.
1. Убеждаются, что электрофорез в первом направлении обеспечивает
оптимальное выделение пика требуемого антигена.
2. Используют большие резервуары для буфера, свежий буфер и новые или
тщательно вымытые фитили так, чтобы не контаминировать агарозу примесями
ранее разделявшихся белков.
4*
52
Глава 2
3. Используют IgG-фракцию антисыворотки в агарозе для уменьшения
загрязнения агарозы белками; доводят концентрацию таким образом, чтобы
нужный пик преципитации полностью сформировался и отстоял от других
пиков.
4. Проводят электрофорез на плите с охлаждением в течение ночи или
большего промежутка времени, чтобы не образовавшие преципитатов молекулы
вышли из геля.
5. Используют несколько пластин, чтобы одновременно получить несколько
пиков для первичной и бустерных инъекций.
6. Вырезают пики и погружают их в физиологический раствор (20 мл в
универсальном стеклянном флаконе) при 4°С не менее чем на неделю, в
течение которой раствор несколько раз меняют. Затем один или несколько
пиков могут быть ре-суспендированы в небольшом объеме PBS с помощью
стеклянного гомогенизатора или электрического смесителя и далее
эмульгированы с ПАФ.
В случае антигенов, при pH 8,6 мигрирующих к катоду, можно вырезать линии
преципитации, образующиеся в результате ИЭФ с полиспецифической
сывороткой. Могут быть использованы только те части линий, которые не
пересекают и не касаются других. Настоятельно рекомендуется использовать
очищенную фракцию IgG и очень энергично отмывать преципитат.
Используя моноспецифичеекую антисыворотку, можно выделять отдельные
антигены из смеси с помощью ракетного ИЭФ (гл. 6). Преимущество данного
метода заключается в том, что он позволяет получить множество идентичных
ракет на одной пластине. Необходимо соблюдать те же указания, что и для
двумерного ИЭФ, однако при этом не требуется осуществлять первый этап
электрофоретического разделения белков. Метод чувствителен к
контаминирующим антителам в так называемой моноспецифической
антисыворотке, которые реагируют с другими компонентами смеси антигенов.
Поэтому убедитесь, что вы используете для иммунизации только нужную часть
ракеты.
3.2.2. Использование полос и реплик на нитроцеллюлозе
Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии до-децилсульфата
натрия (ДСН-ЭПАГ) стал повседневной процедурой для определения
компонентов сложных молекулярных смесей. Электрофоретический перенос
Предыдущая << 1 .. 14 15 16 17 18 19 < 20 > 21 22 23 24 25 26 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed