Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка):
полосы на нитро-целлюлозную мембрану (Вестерн-блоттинг) обеспечивает
возможность не только тестирования специфичности антител, но и позволяет
сконцентрировать макромолекулярный иммуноген для последующего введения
его животным. Показано, что •окрашенные на белок, вырезанные и тонко
измельченные по-
Получение поликлональных антител и контроль их качества
53
лосы сохраняют антигенные свойства. Имеется сообщение о том, что мышей
можно иммунизировать с помощью всего лишь 10 нм белка, адсорбированного
на нитроцеллюлозе [22]. Большие количества антигена, адсорбированного на
нитроцеллюлозе, используются для иммунизации после измельчения в ДМСО
[23].
3.2.3. Простой метод получения ахтиглобулиховой сыворотки с помощью
эритроцитов
При гуморальном ответе животного на эритроциты другого вида образуются
IgM и IgG. Затем антиэритроцитарные антитела "нагружают" на эритроциты-
мишени, которые при введении донору эритроцитов, вызывают образование
антиглобулинов. Этот простой подход позволяет избежать очистки
иммуноглобулинов и дает хорошие результаты. Например, введя кролику
внутривенно 1 мл отмытых в физиологическом растворе эритроцитов барана
(10%-ная суспензия, объем на объем), можно легко получить соответствующие
антиэритроцитарные а/нтитела. При взятии крови через 10 дней после первой
инъекции главным образом получают IgM. Повторное введение антигена через
1 нед и 2 раза в неделю в течение последующих нескольких недель с забором
крови через 2-5 дней после последней инъекции преимущественно
обеспечивает получение IgG. Сыворотки затем могут быть смешаны.
1. Прогревают 0,5 мл смешанной сыворотки при 56 °С в течение 20 мин для
инактивации комплемента. Добавляют к 5 мл отмытой 10%-ной суспензии
эритроцитов, закрывают флакон и быстро перемешивают содержимое
переворачиванием.
2. Медленно перемешивают клетки 20 мин в смесителе с круговым вращением,
а затем отмывают 5 раз холодным PBS.
3. Отмытые и нагруженные антителами клетки могут быть использозаны для
иммунизации овец.
Аналогичный подход может быть, например, использован для получения
кроличьей антисыворотки к мышиному иммуноглобулину. Процедура иммунизации
описана в разд. 5.
Модифицируя метод, можно получить моноспецифические антисывороткп к IgM и
IgG. В этом случае у кролика берут кровь на ранней стадии гуморального
ответа, IgM отделяют от IgG и нагружают на эритроциты. В поздние сроки
выделяют и аналогичным образом используют IgG. Предварительные этапы
заключаются в следующем.
I. Выделение IgM. 5 мл инактивированной нагреванием сыворотки помещают
на колонку с сефадексом G200 (40X3,5 см) в PBS, pH 7,2, пропускают со
скоростью 25 мл/ч и собирают фракции объемом 5 мл. Каждую фракцию
исследуют на агглютинирующую активность, и первые четыре положительных
54
Глава 2
образца, соответствующие первому элюируемому пику (IgM), отбирают и
нагружают на эритроциты.
II. Выделение IgG. 5 мл инактивированной сыворотки, полученной от
повторно иммунизированного кролика, разделяют, как описано выше. В этом
случае четыре образца, соответствующие середине второго элюируемого пика
(IgG), обладающие агглютинирующей активностью, собирают, смешивают вместе
и нагружают на эритроциты. По нашему опыту, антисыворотка, полученная
таким образом, обладает незначительной перекрестной реактивностью с
легкими цепями, которую можно устранить абсорбцией с помощью эритроцитов,
нагруженных антителами другого класса.
3.2.4. Индукция толерантности
Антитела, распознающие минимальные структурные различия между
родственными молекулами одного вида животных, часто трудно получить при
ксеноиммунизации, поскольку иммунный ответ преимущественно направлен
против сильных антигенных различий донора и реципиента. Иногда удается
индуцировать специфическую толерантность по отношению к им-
мунодоминантным эпитопам и, таким образом, изменить специфичность
гуморального ответа. Данный метод может использоваться для получения как
поликлональных, так и моноклональных антител. Мы успешно получали овечью
антисыворотку ко всем аллотипическим антигенам локусов а и b кроличьих
иммуноглобулинов, вводя в/в новорожденным ягнятам 500 мг пула очищенного
ультрацентрифугированием кроличьего IgG, лишенного какой-либо одной
аллотшгаческой детерминанты; в возрасте трех месяцев эту аллель вводили с
ПАФ внутримышечно.
При получении МКА к подклассам IgG человека, специфичных в отношении лишь
тех минимальных различий, которые существуют в областях, определяющих
антигенность подкласса, оказалось полезным получение толерантности у
мышей-продуцентов путем в/б инъекции около 12 мг IgG определенного
подлаеса за неделю до иммунизации другими подклассами [24]. Парапротеины,
используемые для создания толерантности, подвергли биофильтрации путем
пассажа на мышах, сыворотка которых служила в дальнейшем источником
толерогена.
3.2.5. Модуляция гуморального ответа путем образования комплексов
антител с некоторыми определенными эпитопами антигена
