Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 23

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 17 18 19 20 21 22 < 23 > 24 25 26 27 28 29 .. 122 >> Следующая

медленнее. Положение каждого из компонентов после окрашивания на белок
можно сравнить с положением
Получение поликлональных антител и контроль их качества
57
маркеров мол. массы, мигрирующих по контрольной дорожке, что позволяет
определить мол. массу исследуемого белка. Для достижения максимальной
разрешающей способности смесь белков вносят в карманы верхнего
концентрирующего геля (для формирования карманов используют гребенку).
Концентрирующий гель, содержащий меньше акриламида и обладающий
минимальным ситовым эффектом, вместе с буфером, содержащимся в образце,
создает прерывистую буферную систему из хлорид-и глицинатных ионов при pH
6,8, в которой подвижная граница с идущими впереди хлорид-ионами собирает
белки в узкую зону до того, как они войдут в разделяющий гель.
Полиакриламид представляет собой продукт полимеризации акриламида и
какого-либо вещества, образующего поперечные сшивки, - обычно N,N' -
метиленбисакриламида (сокращенно бис-акрилами-да). Полимеризацию
осуществляют в присутствии катализатора - например, системы персульфат
аммония -
N,N,N',N' - тетраметилэтилен-диамин (ТЕМЭД) или рибофлавин - ТЕМЭД,
причем первый наиболее часто используется в случае гелей, содержащих
3-4% акрил-
амида. Высокая химическая и механическая стабильность полиакриламидных
гелей придает им свойства идеальной
Рис. 2.1. Оценка чистоты IgM человека с помощью иммуноэлектрофореза.
Реакция взаимодействия цельной сыворотки с соответствующей антисывороткой
позволяет выявить широкий спектр возможных компонентов. Реакция с
олигоспецифической антинм-муиоглобулиновой сывороткой свидетельствует о
присутствии в неочищенном образце, кроме IgM, других классов
иммуноглобулинов. Обе антисыворотки подтверждают чистоту конечного
продукта, положение которого определено с помощью контрольной
антисыворотки, специфичной к IgM. В лунки внесены: (а) цельная нормальная
сыворотка человека; (Ь) частично очищенный IgM; (с) очищенный IgM. В
канавки внесены: (1) по-лиспецифическая антисыворотка к цельной сыворотке
человека; (2) контрольная сыворотка к IgM человека; (3) контрольная
сыворотка к иммуноглобулинам (IgG, IgA, IgM) человека
поддерживающей среды для электрофореза белков.
II. Реагенты (см. табл. 2.3). Отметим следующее:
1. Акриламид и бис-акриламид представляют собой нейро-токсины,
особенно в неполимеризованном состоянии, но и по-лимеризованный гель
может содержать некоторое количество
58
Глава 2
этих веществ в мономерной форме. Отвешивать реактивы необходимо в маске и
перчатках, в вытяжном шкафу. Обязательно используют перчатки при работе с
растворами.
2. Концентрированные растворы можно хранить около 4нед при 4°С. Не
используют помутневшие растворы. Необходимо защитить растворы акриламида
от света. Растворы ДСН, как и электродный буфер, хранят при комнатной
температуре.
3. Персульфат аммония и ТЕМЭД хранят при 4°С.
4. Растворы геля необходимо дегазировать за 10- 15 мин перед введением
катализатора.
III. Приготовление гелей (см. табл. 2.4 для приготовления разделяющего
геля шириной 14 см и толщиной 3 мм).
IV. Заливка гелей. Различные наборы для приготовления гелей включают пары
стеклянных пластин, тефлоновые гребенки для формирования карманов в
концентрирующем геле, прокладки для достижения требуемой толщины геля,
форму и платформу для заливки геля, зажимы, прибор для вертикального
электрофореза, источник питания,, кюветы для отмывания и окрашивания
гелей, приспособления для высушивания гелей и др. Поставщики
оборудования- см приложение.
1. Отмывают стеклянные пластины, гребенки и прокладки и обезжиривают
их метанолом. Изготовляют форму путем помещения прокладок (мы используем
3-мм прокладки) между пластинами у основания и по бокам и соединяют
зажимами всю конструкцию. Помещают форму вертикально на смазанную жиром,
покрытую резиной платформу для заливки геля и обеспечивают надежное
уплотнение. В некоторых случаях может потребоваться предварительная
заливка нижней части формы 1%-ной (вес на объем) агарозой.
А
В
I
* ;
Рис. 2.2. Двумерный ИЭФ экстракта растворимых антигенов поверхностной
мембраны взрослой особи 5. mansoni. А. Реакция в агарозе с полиспецифи-
ческой антисывороткой, полученной при длительной иммунизации кроликов
низкой дозой смеси антигенов в ПАФ. Б. Реакция в агарозе с мо-
носпецифической антисывороткой, полученной в ответ на иммунизацию
вырезанным пиком преципитации антигена 1 (положение антигена показано иа
верхнем снимке)
Получение поликлональных антител и контроль их качества
59
В
Рис. 2.3. Пример использования двух методов преципитации в геле для
определения чистоты иммуногена с помощью антител. А. Ракетный
иммуноэлектро-¦форез в агарозном геле, содержащем антитела к белкам
цельной сыворотки, для проверки чистоты сывороточного альбумина (в
лунках). Более длинные ракеты - результат реакции с альбумином; внутри
них видны маленькие ракеты - результат реакции с контаминирующим
антигеном в низкой концентрации. Б. Метод Ухтерлони для контроля чистоты
Предыдущая << 1 .. 17 18 19 20 21 22 < 23 > 24 25 26 27 28 29 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed