Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 19

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 13 14 15 16 17 18 < 19 > 20 21 22 23 24 25 .. 122 >> Следующая

Мы используем следующую методику конъюгации перокси-дазы хрена (ПХ) с IgG
[19].
1. Растворяют 10 мг ПХ в 2 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера (pH 7,5),
содержащего 0,1 М NaCl. Добавляют .по каплям при помешивании 400 мкг
СПДП, растворенного в 0,5 мл абсолютного спирта. Реакция протекает в
течение 30 мин при комнатной температуре при периодическом перемешивании.
2. Удаляют избыток СПДП и продукт реакции N-гидрок-сисукцинимид от 2-
пиридил-дисульфид-замещенного фермента путем гель-фильтрации через
колонку с сефадексом G25
Получение поликлональных антител и контроль их качества
49
(1,6X35 см), элюируя PBS замещенную ПХ в первом белковом пике.
3. Идентичную реакцию проводят с СПДП и IgG, используя 10 мг белка, но в
этом случае только 10-15 мкг СПДП в 0,2 мл этанола. Замещенный IgG тоже
элюируют с помощью PBS из колонки с сефадексом G25.
4. Создают активные тиоловые группы на ферменте путем восстановления 2-
пиридил-дисульфидных групп с помощью раствора дитиотреитола из расчета
2,5 мМ на 1 мг замещенного фермента при комнатной температуре. Избыток
восстановителя и пиридин-2-тиона удаляют гель-фильтрацией.
5. Содержащую тиоловые группы пероксидазу и 2-пиридил-дисульфид-IgG
смешивают в соотношении 1 : 1 (вес на вес) и оставляют на 18 ч при 4°С.
6. Отделяют конъюгат и несвязавшийся фермент на колонке с сефакрилом S-
200 (1,6X95 см), используя для элюции PBS. Первый белковый пик с
ферментной активностью содержит конъюгат с мол. массой около 200 000.
VII. Конъюгация углеводных гаптенов с носителями.
Существует несколько методов конъюгации углеводных гаптенов с носителями,
выбор метода зависит от использования карбоксильных (кислые углеводы) или
гидроксильных групп [14].
Если карбоксильные группы отсутствуют, можно провести
карбоксиметилирование с помощью хлорацетата, который связывается с
гидроксильными группами с образованием карбоксила [20]. Используя этот
прием, многие углеводы, так же как и кислые полисахариды, удается затем
соединить с белками через карбоксильные группы, например, с помощью
карбо-диимидной реакции.
Карбоксиметилированные и кислые углеводы (с собственными карбоксильными
группами) широко применяют как носители в исследованиях гуморального
ответа на тимуе-неза-висимые синтетические иммуногены. Аминоэтилирование
позволяет подготовить эти носители для спонтанной конъюгации с гаптенами,
типа ТНБС. Аминоэтил-карбоксиметил-фиколл (АЭКМ-фиколл), соединенный с
ТНФ, - один из наиболее популярных тимус-независимых иммуногенов. Для его
приготовления используют следующий метод [14]:
1. Растворяют 40 мг АЭКМ-фиколла в 2 мл 0,1 М ЫаНСОз. Добавляют по каплям
50 мкл ТНБС в концентрации 26 г/л.
2. Перемешивают смесь 18 ч при 4°С, а затем диализуют против
физиологического раствора (4°С, 4 дня) для удаления несвязавшегося
гаптена. Это позволяет связать около 4,2 молекул ТНФ с каждыми 100 кДа
носителя. АЭКМ-фиколл имеет мол. массу около 400 000.
4-997
50
Глава 2
3.2. Получение макромолекул для иммунизации
Большое разнообразие макромолекул, изучаемых с помощью антител, включает
не только естественные продукты животных и растений, но и продукты
микробного происхождения, и синтетические вещества. Приготовление
поликлональной антнсыворотки к определенным молекулам может включать
предварительную очистку, если нельзя получить очищенный коммерческий
препарат. Для компонентов клеточной поверхности современный подход - это
получение моноклональных антител требуемой специфичности; при этом
решается проблема очистки иммуногена (см. гл. 3). С другой стороны, с
помощью уже существующих антител можно очистить компоненты клеточной
поверхности, а также проводить обогащение клеток, экспрессирующих
антиген-мишень. Эти подходы обсуждены в гл. 5. Метод экстракции имеет
большое значение в тех случаях, когда необходимо получить
полиспецифическую антисыворотку к смеси иммуногенов, например
экстрагированных клеточных мембран, гомогенатов тканей, разрушенных
ультразвуком бактерий, вирусов и паразитов. Невозможно в этой главе
привести детальное руководство по экстракции и очистке огромного
разнообразия иммуногенов. Существует специальная литература, посвященная
методам получения углеводных, бактериальных, вирусных, грибковых и
паразитарных антигенов [21]. Очистка с помощью аффинной хроматографии
описана в гл. 5, а приготовление иммуноглобулинов
(как иммуногенов)-в разд. 10 настоящей главы. Ниже приведены методы
получения иммуногенов и подходы к иммунизации, имеющие особое значение.
3.2.1. Использование иммунных комплексов
Преципитат обладает высокой иммуногенностью и как бы представляет собой
естественную форму адъювантированного антигена. Использование
нанограммовых количеств иммуногена в составе преципитата позволяет
получать хорошую анти-сыворотку при повторном введении с адъювантом.
I. Преципитаты, получаемые в пробирке. С помощью небольших исходных
количеств антисыворотки иммуноген может <быть селективно осажден из смеси
Предыдущая << 1 .. 13 14 15 16 17 18 < 19 > 20 21 22 23 24 25 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed