Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 24

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 18 19 20 21 22 23 < 24 > 25 26 27 28 29 30 .. 122 >> Следующая

альбумина; лунка 1 содержит полиспецифическую сыворотку к сывороточным
белкам, лунка 2 - моно-специфнческую сыворотку к альбумину. В лунку а
внесен неочищенный препарат альбумина, который дает множественные линии
преципитации с полиспе-цифическон антисывороткой. В лунку b внесен
очищенный альбумин, дающий одну линию с полислецифпческой сывороткой и
взаимодействующий с контрольной антнсывороткой к альбумину
2. Готовят смесь для разделяющего (нижнего) геля требуемой концентрации,
добавляют и перемешивают катализатор.
3. Заливают раствор геля плавно, но быстро в форму с помощью шприца или
пипетки, стараясь не оставить пузырьков воздуха. Сразу же после заливки
на гель наливают слой воды, чтобы исключить доступ воздуха и улучшить
полимеризацию. Это позволяет выровнить и сгладить верхний край геля. На
гель можно нанести 0,1%-иый водный раствор ДСН, изо-амиловый спирт, или
н-бутанол (последние имеют меньшую плотность, чем вода, что снижает
возможность смешивания с
Таблица 2.3. Реагенты, используемые для электрофоретического разделения
белков в гелях
Исходные растворы акриламида Исходный раствор 1:
Акриламид 44 г Доводят до 100 мл дис-
бцс-акриламид 0,8 г Исходный раствор 2: тиллированной водой
Акриламид 30 г Доводят до 100 мл дис-
fiuc-акриламид 0,8 г (Фильтруют через бумагу, например, Whatman № 1)
Буфер для образцов тиллированной водой

10%-ный (вес на объем) ДСН 5 мл
0,5 М трис-НС1, pH 8,8 2,5 мл
Дистиллированная вода 5 мл
Глицерин 2,5 мл
2-Меркаптоэтанол 0,25 мл •!
5%-ный (вес на объем) бромфеноловый снний Буфер для разделяющего геля, pH
8,9 0,2 мл
Трис 36,6 г
1 М НС1 48 мл
Дистиллированная вода до 100 мл
Буфер для концентрирующего геля
Трис Концентрированная КС1 (доводят pH до 7,0) Дистиллированная вода до
100 мл Другие компоненты геля 10 %-нын раствор (вес на объем) ДСН в
дистиллированной воде Катализатор: 10%-ный раствор (вес на объем)
персульфата аммония в дистиллированной воде - готовят свежий раствор
непосредственно перед применением ТЕМЭД (длительно не хранят) Электродный
буфер (pH 8,3) 12,1 г
Трис 30 г
Г лицин 144 г
ДСН 10 г
Дистиллированная вода Раствор красителя Метанол : уксусная кислота : вода
(25 : 10 : 65 по объему) 0,03%-ный (вес на объем) раствор кумасси ярко-
сннего (перед использованием фильтруют) Раствор для отмывания красителя
Состоит из тех же компонентов, за исключением кумассн ярко-сннего До 10
л
Получение поликлональных антител и контроль их качества
61
Таблица 2.4. Приготовление разделяющего геля шириной 14 си и толщиной 3
мм
Разделяющий гель (мл) Концентрирующий гель (мл)
14%-ный гель
Исходный раствор 1 18,75 Исходный раствор 2 5,0
10%-ный ДСН 1,50 0,3
1.5 М трнс-НС1, pH 8,8 18,75 7,5
Дистиллированная вода 20,0 16,0
ТЕМЭД 0,140 0,08
10%-ный персульфат аммония 0,20 0,10
Продолжительность инкубации 15 мин 20 мии
10%-ный гель
Исходный раствор 1 22,2 Исходный раствор 2 2,0
10%-ный ДСН 0,66 0,1
1,5 М трис-HCl, pH 8,8 16,6 2,5
Дистиллированная вода 25,18 5,3
ТЕМЭД 0,066 0,02
10%-ный персульфат аммония 0,66 0,10
Продолжительность инкубации 15 мин 15 мин
гелем). Однако, если гель будет храниться в течение ночи, лучше
использовать воду или разделяющий буфер. Оставляют гель для полимеризации
не менее чем на 30-45 мин, лучше - в течение ночи.
4. Приготовляют концентрирующий гель. Перед добавлением катализатора
удаляют раствор, покрывающий слой нижнего геля, и ополаскивают гель
водой. Добавляют катализатор, смешивают с концентрирующим гелем и
заливают его. Немедленно вставляют гребенку требуемого размера для
формирования карманов. На концентрирующий гель наливают воду для
предотвращения испарения и выдерживают 20-30 мин.
5. Тем временем соединяют образцы с соответствующим буфером в разных
объемах и помещают их в кипящую водяную баню на 2-5 мин. Образцы должны
содержать 2-5 мг/мл белка из расчета 50 мкл (100-250 мкг) на лунку.
Оптимальные концентрации варьируют в зависимости от состава исследуемой
смеси, и их определяют опытным путем.
6. Удаляют гребенку из концентрирующего геля и трижды-тщательно промывают
карманы 0,1%-ным раствором ДСН в-0,5 М трис-HCl для удаления акриловой
кислоты, образовавшейся в ходе полимеризации.
V. Проведение электрофореза
1. В карманы вносят образцы - высота образца должна быть меньше, чем
расстояние от дна кармана до верхней границы разделяющего геля. Заполняют
карманы электродным буфером.
62
Глава 2
2. Заполняют прибор для электрофореза электродным буфером и включают
циркуляцию охлаждающей воды, если таковая предусмотрена. Помещают
пластины с гелем в прибор, заполненный буфером, и замыкают электрическую
цепь.
3. Подключают ток 10-15 мА на 1,5 ч, а затем увеличивают силу тока вдвое
на 1-2 ч до тех пор, пока фронт исследуемых образцов не окажется в 1 см
от конца пластины. Отключают ток, размыкают электрическую цепь и
извлекают пластины с гелем.
VI. Окрашивание и высушивание гелей.
1. Разнимают пластины и аккуратно вынимают гель под водой в небольшой
Предыдущая << 1 .. 18 19 20 21 22 23 < 24 > 25 26 27 28 29 30 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed