Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 18

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 12 13 14 15 16 17 < 18 > 19 20 21 22 23 24 .. 122 >> Следующая

метнламинопропил)карбодиимида в 0,5 мл дистиллированной воды, добавляют
его в первый раствор и инкубируют 2 ч при комнатной температуре,
периодически перемешивая.
3. Диализуют смесь в течение 2 дней при 4°С против 1 л PBS (pH 7,2),
меняя несколько раз диализный буфер для удаления несвязавшихся реагентов.
С помощью аминогликозидов, меченных тритием (Amersham International),
разбавленных немеченым гаптеном в известной пропорции, было показано, что
приведенный выше метод конъюгации дает соотношение 20-90 гаптенных групп
на одну молекулу тиреоглобулина (мол. масса 650 000) и 5-20 на одну
молекулу альбумина (мол. масса 66 000). Это было установлено путем
отделения непрореагировавшего аминогликози-да от конъюгата при нанесении
смеси на колонку с сефадексом G25 в PBS и сбора первого, максимального
белкового пика.
III. Конъюгация (1-D-галактозидазы и IgG овцы с использованием N ,N'-О-
фенилендималеимида.
Получение поликлональных антител и контроль их качества
4-7
1. Диализуют 14 мг IgG овцы в 2 мл против 0,1 М ацетатного буфера (pH
5,0) в течение ночи и центрифугируют при 3000 об/мин 20 мин для удаления
нерастворенного белка. Восстанавливают, добавляя 10 мМ (2,27 мг) 2-
меркаптоэтилами-на, и инкубируют при 37 °С 90 мин.
2. Отделяют IgG от компонентов с меньшей мол. массой на колонке с
сефадексом (1X40 см) G25, уравновешенной ацетатным буфером.
3. Определяют количество IgG по поглощению при 280 нм (1 ¦мг/мл, 1 см, =
1,45).
4. Добавляют 3 мг в 1 мл восстановленного IgG по капле к 1 мл насыщенного
раствора Ы,Ы'-0-фенилендималеимида (0,75 мМ) при 0°С. Инкубируют смесь
при 30 °С 20 мин, затем 'наносят на колонку с сефадексом G25 для удаления
непрореагировавшего связывающего агента.
5. Доводят концентрацию IgG до оптической плотности около 1,0 при 280 нм.
Инкубируют каждый 1 мл с 20 мкл fl-D-ra-лактозидазы (5 мг/мл) 20 мин при
30 °С. Нейтрализуют смесь 1 М NaOH, добавляя 15-20 мкл/мл.
6. Добавляют по 2 мкл 5%-ного БСА и 1 М MgCb для стабилизации фермента.
Выдерживают смесь при 4°С 72 ч и очищают конъюгат на колонке с сефарозой
6В (1x40 см), уравновешенной 0,01 М натрий-фосфатиым буфером (pH 7,0),
содержащим 0,1 М NaCl, 0,1% азида натрия, 1 мМ MgGl2 и 0,01% БСА.
Используют этот буфер как для элюции, так и для хранения конъюгата.
IV. Безводная методика конъюгации гликохолевой кислоты и БСА [17].
Данный метод является основным для конъюгации стероидов с белками. Мы
используем следующую модификацию [18]:
1. Растворяют 537 мг (1,1 мМ) гликохолевой кислоты в 10 мл диоксана.
Добавляют 0,25 мл (1,1 мМ) три-н-бутиламп-на, а затем - 0,14 мл (1,1 мМ)
изобутилхлоркарбоната. Реакцию проводят 20 мин при 4°С. Добавляют 1,5 г
(0,02 мМ) БСА в 85 мл смеси воды и диоксана (1:1, объем на объем),
¦содержащей 1,5 мл 1 М NaCl.
2. Через 1 ч добавляют 2 мл 1 м NaOH и оставляют смесь еще на 3 ч при
4°С. Добавляют ледяной (0°С) ацетон в реакционную смесь и собирают
образовавшийся преципитат центрифугированием (5000 g, 30 мин, 4°С).
3. Суспендируют преципитат в ЫаНСОз (pH 8,5) и повторно обрабатывают
ледяным ацетоном. Ресуспендируют преципитат в КаНСОз (pH 8,5) и диализуют
против 0,5 М фосфатного буфера 48 ч. Последний этап необходим для полного
удаления свободной гликохолевой кислоты из конъюгата. Анализ
48
Глава 2
аабуференного раствора конъюгата с помощью За-гидрокси-стероид-
дегидрогеназы показывает, что можно связать 12 молей гликохолевой кислоты
с 1 М альбумина.
V. Конъюгация путем превращения ароматических аминогрупп гаптена в группы
диазония.
Реакцию проводят в два этапа: диазотируют аминогруппы гаптена с помощью
НС1 и NaN02, а затем спонтанно конъюгируют их с тирозином белка-носителя.
Использование бифункциональной соли диазония (бис-диазотированный бензи-
дин) обеспечивает спонтанное образование мостиков между гаптенами с
ароматическими аминокислотами (т. е. пептидами) и белками. Пример такой
двухступенчатой реакции - конъюгация яара-аминобензойной кислоты с БСА.
1. Растворяют 100 мг БСА в 10 мл 0,5 М боратного буфера (pH 9,0).
2. Обрабатывают 15 мг /zapa-аминобензойной кислоты 1,6 мл 0,2 М НС1 и
доводят объем до 5 мл дистиллированной водой. Охлаждают до 0°С на ледяной
бане.
3. Растворяют 8 мг NaN02 в 0,5 мл дистиллированной воды при 0°С и
добавляют к раствору яара-аминобензойной кислоты. При этом образуется
свободная азотистая кислота, определяемая по окрашиванию иодно-
крахмальной бумажки в синий цвет. Избыток НС1 необходим для образования
гидрохлорида амина и азотистой кислоты, с тем чтобы последующая реакция
соединения протекала в кислой среде.
4. Добавляют по капле парадиазония хлорид бензойнокислый в раствор БСА.
Через 1 ч нейтрализуют раствор и удаляют несвязанный диазоний интенсивным
диализом.
VI. Конъюгация путем тиолирования неароматических аминогрупп гаптена.
Данный широко используемый метод включает предварительную обработку
гаптена и белка-носителя путем соединения их аминогрупп с N-сукцинимидил-
З (2-пиридилдитио) про-прионатом (СПДП) при pH 7,5.
Предыдущая << 1 .. 12 13 14 15 16 17 < 18 > 19 20 21 22 23 24 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed