Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка):
необходима химическая активация или образование мостиков. Здесь
существует несколько возможностей, выбор которых зависит от
функциональных групп данного гаптена, от требуемой пространственной
ориентации гаптена, расстояния между ним и носителем и от влияния
конъюгации на биологические и антигенные свойства. Этот вопрос детально
рассмотрен Паркером L12], методы конъюгации, не перечисленные ниже,
освещены в двух обзорах [13, 14]. Далее приведены примеры, иллюстрирующие
основные подходы.
3.1.1. Методы спонтанного связыванхя
I. ТНФ-бычий гамма-глобулин (ТНФ-БГГ). 2,4,6-тринитро-
бензолсульфоновая кислота (пикрилсульфоновая кислота, ТНБС)
взаимодействует с белками при pH 10-11 при комнатной температуре в водном
растворе, при этом сульфат отщепляется и ТНФ замещает белковую
аминогруппу с образованием ТНФ-гаптена.
1. Растворяют 50 мг БГГ в 5 мл 0,1 М бикарбонатного буфера
(НаНСОз/На2СОз), pH 9, в 20-мл стеклянном флаконе,
2. Отвешивают 25 мкг ТНБС на 1 мг белка-носителя (т. е. 1,25 мг) и
растворяют в 1 мл того же буфера. Короткую (10 см) и узкую диализную
трубочку обмывают дистиллированной водой, туго завязывают с одного конца,
помещают внутрь раствор гаптена с помощью пастеровской пипетки и
завязывают другой конец так, чтобы получился небольшой диализный мешочек.
3. Погружают мешочек в раствор белка и медленно перемешивают последний на
ледяной бане с помощью магнитной мешалки в течение ночи при 4°С.
4. Заполняют небольшую (30x1,25 см) хроматографическую колонку сефадексом
G25 (Pharmacia), уравновешенную PBS при pH 7,2, и пропускают через нее
смесь с помощью
Получение поликлональных антител и контроль их качества
45
PBS. Собирают первую видимую желтую фракцию, содержащую конъюгат,
свободный гаптен задерживается в верхней части колонки.
5. Для определения молярного отношения ТНФ : БГГ в конъюгате готовят
разведения примерно 1 : 30 и определяют на спектрофотометре пики
поглощения при длинах волн 355 нм (для гаптена) и 280 нм (для белка-
носителя).
ОП 1 мг/мл ТНФ (мол. масса 229), в кювете 1 см = 62,9.
ОП1 мг/мл БГГ (мол. масса. 150000), в кювете 1 см=1,45.
Например, получены следующие данные:
Оптическая плотность (ОП) при 355 нм при разведении 1 : 30 равна 0,137,
ОП при 280 нм равна 0,185
0,137-30
Содержание ТНФ в конъюгате = 62 g-=0,07 мг/мл.
0,185-30
Содержание БГГ в конъюгате =-- =3,8 мг/мл.
0,07 3,8
Молярное соотношение гаптен : белок = 22д- : 150000 ~
Поскольку ТНФ, конъюгированный с белком, обеспечивает ~40%
светопоглощения при 280 нм, то, следовательно, истинное соотношение
близко к 20.
II. ДНФ-гемоцианин краба Maia squinado. Простой метод получения
конъюгата заключается в следующем [15]:
1. 50 мкг гемоцианина растворяют в 10 мл 0,1 М боратно-го буфера, pH 8,5.
2. Этот раствор смешивают с 9 частями (по весу) 2,4-ди-нитрофлуоробензола
(ДНФБ) в масле.
3. Нагревают смесь до 37 °С для перевода гаптена в водный раствор.
Перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем интенсивно
диализуют против физиологического раствора при 4°С для удаления
свободного ДНФБ.
Данный метод позволяет получить соотношение ДНФ : гемоцианин = 150,
учитывая, что мол. масса гемоцианина составляет около Ю6.
3.1.2. Присоединение путем активации и формирования мостиков
В настоящее время известны три основных подхода для присоединения гаптена
к белку-носителю:
1. Формирование мостиков между группами аминокислот гаптена и носителя
путем введения диизоцианатов, галонитро-фенолов или имидоэфиров.
2. Использование бифункциональных солей диазония для формирования
мостиков между остатками тирозина, гистидина или лизина.
46
Глава 2
3. Активация карбоксильных групп гаптена для взаимодействия с
аминогруппами белка-носителя с образованием связи СО-NH. Для этого
применяют такие вещества, как карбоди-имиды, алкилхлороформаты и соли
изооксазолия.
I. Конъюгация уреазы с IgG овцы одноэтапным методом с использованием
глутарового альдегида.
1. 5 мг очищенного IgG овцы в 2 мл диализуют в течение ночи против 0,1 М
фосфатного буфера (pH 6,8) при 4°С. При перемешивании добавляют 20 мг
уреазы и 50 мкл 1%-ного раствора глутарового альдегида.
2. Инкубируют смесь при комнатной температуре 2 ч, а затем добавляют 200
мкл 1 М раствора лизина, pH 7,0, чтобы блокировать оставшиеся участки
связывания. Спустя еще 2 ч диализуют смесь против PBS (pH 7,0) при 4°С в
течение ночи и центрифугируют (40 000 g, 1 ч).
3. Для удаления непрореагировавшей уреазы наносят конъюгат на колонку с
сефадексом G25 в PBS и собирают первый белковый пик.
II. Связывание антибиотиков-аминогликозидов (амикацина, гентамицина) со
свиным тиреоглобулином или бычьим сывороточным альбумином (БСА) с помощью
водорастворимого кар-бодиимида [16\.
1. Растворяют 40 мг антибиотика в 0,5 мл дистиллированной воды и доводят
pH до 5 (если необходимо) с помощью 1 М НС1. Добавляют 20 мг носителя,
медленно растворяя его и избегая образования пены.
2. Растворяют 100 мг хлористоводородного 1-этил-3 (3-ди-
