Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 26

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 20 21 22 23 24 25 < 26 > 27 28 29 30 31 32 .. 122 >> Следующая

3. Приготавливают равный объем раствора иммуногена (суспензии,
преципитата) в воде и набирают его в шприц через иглу № 20, не втягивая
воздуха.
4. Энергично вводят водную фазу с иммуиогеном в масляную фазу и набирают
весь объем в шприц аккуратно, без воздуха. Снимают иглу со шприца и
присоединяют иглу с двумя канюлями или тефлоновый адаптор; удаляют
воздух, присоединяют с другой стороны второй шприц с поршнем, смазанным
вазелином. Убеждаются, что оба соединения хорошо уплотнены. Многократно
перегоняют
эмульсию из одного шприца в другой, пока белая эмульсия не загустеет и не
возникнет сильного сопротивления.
Эмульсию можно получить и с помощью одного шприца, набирая водную и
масляную фазу из флакона в шприц и выдавливая обратно до тех пор, пока
эмульсия не станет вязкой.
5. Стабильная водно-масляная эмульсия считается сформированной, когда
капля ее, упавшая из иглы в холод-
Рис. 2.6. Флотационная проба для проверки стабильности водно-масляной
эмульсии иммуногена. А. Нестабильная, неправильно приготовленная
эмульсия, которая разрушается в воде. Б. Стабильная эмульсия, капля не
расплывается в воде
5-997
66
Глава 2
ную воду, быстро тонет, а затем всплывает, не распадаясь (рис. 2.6). Если
капля распадается, эмульсию продолжают взбивать и испытывают снова. Это
очень ответственный этап, поскольку нестабильная эмульсия после введения
будет быстро распадаться в тканях.
6. Переносят готовую эмульсию обратно во флакон, а затем в 1-2-мл
стеклянные шприцы со смазанными поршнями в объеме, требуемом для одной
инъекции. Присоединяют иглу подходящего размера и убеждаются, что она
плотно прилегает, поскольку во время инъекции скорее всего потребуется
приложить значительное давление. Методика иммунизации с адъювантом
подробно описана ниже (разд. 5.1.4).
4.1.2. Полный адъювант Фрейнда (ПАФ)
1. Используя сухой порошок убитых нагреванием М. tuberculosis (H37Rv или
H37Ra) или М. butyricum, готовят концентрированную суспензию-10 мг/мл,
растирая материал в небольшом объеме Байола F в ступке.
2. Эту суспензию добавляют к НАФ из расчета 0,5 мг микобактерий по сухому
весу на 1 мл, т. е. 1 мл концентрированной суспензии на 20 мл НАФ.
Перед использованием суспензию тщательно перемешивают, особенно после
хранения (4°С), поскольку микроорганизмы при этом оседают. ПАФ можно
стерилизовать автоклави-рованием или облучением; после этого он хранится
неопределенно долго. Эмульсию с ПАФ готовят так же, как и с НАФ (см.
выше).
Предупреждение: попадание ПАФ в кожу вследствие не-
осторожного укола может вызвать очень болезненную локальную
антимикобакториальную воспалительную реакцию. Необходимо быть предельно
внимательным. Из места укола выдавливают кровь и обращаются за
медицинской помощью, даже если повреждение кожи незначительно.
4.2. Белки, адсорбированные на квасцах
Для приготовления адсорбированного на квасцах сывороточного альбумина или
IgG в концентрации 10-20 мг/мл рекомендуется следующий метод [28].
1. К Ю мл белка добавляют 4,5 мл 1 м ЫаНСОз при 20 °С и перемешивают.
2. Медленно при перемешивании добавляют 10 мл 0,2 М раствора квасцов
(KA1[S04]2- 12Н20) в дистиллированной воде. Оставляют смесь при комнатной
температуре на 15-20 мин, а затем центрифугируют (3000g, 10 мин).
Получение поликлональных антител и контроль их качества
67
3. Перед использованием трижды отмывают преципитат PBS. Его можно
хранить с 0,01%-ным (вес на объем) раствором тиомерсала.
Методы получения других белков, адсорбированных на квасцах, детально
описаны в литературе [29]. Такие адсорбированные антигены широко
применяются для в/м или в/б иммунизации; кроме того, их можно
использовать, введя в водную фазу эмульсии, приготовленной с ПАФ или НАФ.
4.3. Бактериальные суспензии в качестве адъювантов
Для иммунизации грызунов обычно применяют суспензию убитых клеток В.
pertusis (1010 бактерий в 1 мл). При внут-рибрюшинных инъекциях ее обычно
вводят в комплексе с белками, адсорбированными на квасцах (2-109 бактерий
на одну инъекцию). Суспензии убитых нагреванием клеток В. Pertussis (при
введении мышам) и Proteus vulgaris 0Х 19 (при введении кроликам)
использовали для выделения антибактериальных антител, которыми в
последующем нагружали микроорганизмы для выработки антиаллотипических и
антиидиотипиче-сних сывороток у животных аутологичных видов. Детали
данного метода описаны в разд. 6.5 и 6.6.
4.4. Липосомы
Ниже приведена методика приготовления липосом, содержащих иммуноген [8,
9].
1. Растворяют 20 мг сфингомиелина и 8 мг холестерина в 3 мл хлороформа и
добавляют 3 мл эфира.
2. Обрабатывают ультразвуком на бане до получения однородной водно-
масляной эмульсии вместе с иммуногеном (10 мг), растворенным в
сбалансированном солевом растворе (BSS: 5,5 мМ глюкозы, 0,4 мМ КН2Р04,
1,2 мМ Na2HP02X Х7Н20. 1,3 мМ СаС12• 2Н20, 5,4 мМ КС1, 136 мМ NaCl, 1 мМ
MgCl2-6H20, 0,8 мМ MgS04-7H20).
3. Доводят объем до 2 мл с помощью BSS и обрабатывают 0,1%-ной (конечная
Предыдущая << 1 .. 20 21 22 23 24 25 < 26 > 27 28 29 30 31 32 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed