Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 22

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 16 17 18 19 20 21 < 22 > 23 24 25 26 27 28 .. 122 >> Следующая

В некоторых случаях удается изменить выраженность гуморального ответа на
полидетерминантный антиген путем связывания с ним антител (моноклональных
антител, специ-
Получение поликлональных антител п контроль их качества
55
фичных к определенным эпитопам) и применения полученного комплекса для
иммунизации. Недавно было показано [25], что у мышей в ответ на введение
IgG* человека образуется большое количество анти-Я-антител, в том случае,
когда молекула IgG связана с одним или более моноклональным антителом к
¦у-цепи. Однако выработка анти-Я-антител подавляется моноклональными
антителам,и к Я-цепи. Более того, образование комплекса IgG с
моноклональными антителами, специфичными к у-цепи (анти-Fcy), усиливает
ответ на слабо им-муногенный домен у 1, в то время как не удалось
получить ответ на Су 1 у мыши, инъецированной IgG, связанным с
моноклональными антителами к Су 1. Аналогичную супрессию ответа не
удавалось получить и при связывании антител с сильно иммуногенными
участками молекулы. Этот подход важен с точки зрения стратегии изменения
специфичности гуморального ответа к разным участкам молекул с низкой или
умеренной иммуногенностью.
. ' 3.3. Контроль чистоты
и состава растворимых иммуногенов
При получении моноспецифических антител основные проблемы обусловлены не
уровнем гуморального ответа, а необходимостью абсорбции антител
нежелательной специфичности, образующихся вследствие различных
загрязнений иммуногена. Поэтому очень важно контролировать чистоту
иммуногена и идентифицировать примеси. Даже в том случае, если они не
могут быть удалены, знание их природы позволит в последующем провести
абсорбцию антисыворотки. Если задача заключается в получении
полиспецифических антител, то не менее важно продемонстрировать
неоднородность смеси, поскольку это служит отправной точкой в успешном
достижении баланса между разнообразными компонентами антисыворотки.
3.3.1. Методы, основанные на использовании антител
Данные методы основаны на использовании полиспецифических антнсывороток
для определения либо чистоты выделенного антигена по сравнению с исходным
материалом, либо качества контрольного реагента при получении новой
антисыворотки с эквивалентной полиспецифичностью.
В этом отношении эффективны такие методы, как двойная диффузия по
Ухтерлони (наименее чувствительный метод), иммуноэлектрофорез (для
индивидуального антигена или смеси антигенов), ракетный ИЭФ (для
индивидуального антигена) и двумерный ИЭФ (для определенного антигена или
смеси антигенов). Данные методы описаны в гл. 6. На рис. 2.1 при-
Гб
Глава 2
ведены электрофореграммы IgM человека из цельной сыворотки. Использованы
контрольная антисыворотка к основным компонентам исходной смеси (антитела
к цельной сыворотке человека) и вторая специфическая контрольная
антисыворотка к молекулам, подлежащим очистке (к р-цепи IgM человека) в
качестве положительного контроля.
На рис. 2.2, А показано распределение пиков антигенов взрослой особи
Schistosoma mansoni, полученное методом двумерного ИЭФ с помощью
полиспецифической антисыворотки, при этом может быть проконтролирована
чистота отдельных антигенных компонентов. Рис. 2.3 иллюстрирует, каким
образом чистота иммуногена может быть проверена с помощью метода
Ухтерлони и ракетного ИЭФ.
3.3.2. Электрофоретическое разделение белков в геле.
Проведение электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии
додецилсульфата натрия (ДСН-ЭПАГ)
ДСН-ЭПАГ - это основной метод, который повседневно применяют для
аналитического разделения белков. Он требует специального оборудования и
дорогостоящих реагентов, но незаменим в процессе получения и исследования
антител. Ценность метода заключается не только в его высокой разрешающей
способности в широком диапазоне мол. масс, но и в том, что с помощью
дополнительных этапов он позволяет определить специфичность антител. Мы
не можем перечислить все варианты данного метода, поэтому отсылаем
читателя к специальной литературе [26]. В данном разделе мы ограничимся
лишь кратким описанием принципа и простейшей методики, применяемой для
анализа белков. Дополнительные этапы, необходимые для воспроизведения
методики при определении специфичности антител, приведены в гл. 6.
I. Принцип метода. Когда белки кипятят в присутствии ДСН и
восстановителя (например, 2-меркаптоэтанола), они распрямляются и
связывают около 1,4 г ДСН на 1 г белка. Пептидная цепочка приобретает
форму жесткого эллипсоида вращения. Его малая ось имеет постоянную длину,
а размер большой линейно связан с мол. массой белка. В результате
связывания ДСН полипептидные цепи приобретают однородный отрицательный
заряд, в результате чего отношение заряд : масса у них становится
постоянным. Когда в соответствии с этим зарядом они электрофоретически
перемещаются в полиакриламидном геле, их подвижность обратно
пропорциональна логарифму массы. Таким образом, небольшие молекулы
движутся быстрее и мигрируют дальше, а более крупные перемещаются
Предыдущая << 1 .. 16 17 18 19 20 21 < 22 > 23 24 25 26 27 28 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed