Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 108

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 102 103 104 105 106 107 < 108 > 109 110 111 112 113 114 .. 122 >> Следующая

"одностадийный" бивалентный сшивающий агент, как БДБ, добавляют
непосредственно и смеси эритроцитов ,с антигеном. При этом,, однако,
'невозможно ^предотвратить образование нежелательных'комплексов антиген -
антиген или эритроцит - эритроцит, а также модификацию антигена сшивающим
агентом.
Первый удовлетворительный "двухстадийный" реагент,, таннин, был предложен
Бойденом [7]. Если эритроциты обработать таннинами (полифенилгликозидами
растительного происхождения) в среде, не содержащей белков, то одна часть
молекулы Таннина свяжется с поверхностным протеином эритроцита, другие же
белок-связывающие группы останутся (после осторожного отмывания)
доступными для связывания растворимых белковых антигенов. После того как
весь имеющийся в наличии таннин свяжется с эритроцитами, добавление
(белкового антигена приведет к его более эффективной фиксации на
эритроцитах. При этом происходит лишь, незначительная модификация
антигена или же она совсем, отсутствует. В принципе данный метод,
следовательно, более удовлетворителен, чем "одностадийный". Позднее он
был усовершенствован Ставитским [8].
Известны и другие сшивающие реагенты, например ди-фтординитробензол [6]
или диизоцианат [9]. Однако один из них приобрел особенно большую
популярность. Это - глута-ровый диальдегид, чаще называемый
глутаральдегидом. Как и при использовании БДБ, стандартное количество
сшивающего
256
Глава 7
агента добавляют к смеси отмытых эритроцитов и белкового антигена [10,
11]. Перекрестное Связывание 'происходит быстро и заканчивается через
несколь'ко минут. Кроме того, глу-таральдегид и обработанные эритроциты
более стабильны, чем нативные эритроциты (обработка БДБ), поэтому их
можно хранить при 4 °С в течение нескольких недель. Однако белковый
антиген может подвергаться значительной модификации в результате
взаимодействия тирозильных, имидазольных, сульфгидрильных и аминогрупп с
альдегидом. Невозможно использовать глутаральдегид в качестве
"двухстадийного" реагента, поскольку обе его активные группы быстро и
легко вступают во взаимодействие с соответствующими группами
определенного эритроцита, и реагент, являющийся липофиль-ным, легко
проникает внутрь эритроцита (в отличие от формальдегида) и фиксирует
внутриклеточные белки [12]. Тем не менее можно непосредственно нагрузить
белки на поверхность эритроцитов, предварительно обработав клетки
формальдегидом, глутаральдегидом или другими альдегидами, а затем отмыв
их [12, 13]. Для этого необходима лишь инкубация обработанных указанным
Способом эритроцитов с небольшим количеством ангигена. Нагруженные
эритроциты сохраняют антигенную активность неопределенно долго, даже
'после повторного отмывания. Нагруженные к'летки могут храниться ;в азиде
и использоваться в течение длительного периода времени. Другой метод,
предусматривающий связывание антигена чтри участии альдегидных групп,
заключается в мягком окислении перйодатом углеводных групп на поверхности
эритроцитов с последующим добавлением белкового антигена к эритроцитам,
несущим вновь образованные реактивные группы. [14].
Простой прямой "одностадийный" сшивающий агент, хлорный хром, впер'вые
предложенный Яндлом и Симмонсом [15], получил широкое распространение
после своего повторного внедрения благодаря работам Голда и Фуденберга
[16]. Помимо простоты использования, данный реагент обладает еще целым
рядом преимуществ: связанный с эритроцитами
белок практически не подвергается модификации; кроме того, данный метод
обеспечивает более эффективное связывание (лимитируемое используемым
количеством хлорного хрома), чем непосредственная фиксация антигена на
консервированных клетках [17]. Данный способ настолько мягок, что даже
Связанные антитела сохраняют активность, в то время как в результате
реакции с глутаральдегидо!м они денатурируются. Удовлетворительная
фиксация на эритроцитах с сохранением активности наблюдается и для
стафилококкового белка А и лектинов (в том случае, если они не реагируют
с остатками
Гемагглютинация и реакции антителозависимого гемолиза
257
сахаров на поверхности эритроцитов). В случае правильного выбора
животного в качестве источника получения эритроцитов и строгом соблюдении
стерильных условий на всем протяжении работ, нагруженные клетки удается
сохранять без лизиса при 4 °С в течение нескольких недель; при этом их
гем|-агглютинирующая активность не теряется.
5.2. Связывание белковых антигенов с эритроцитами при помощи хлорного
хрома
5.2.1. Материалы и реагенты
Стерильные стеклянные пробирки 75x13 мм с крышкой.
Смеситель Вортекс.
Оборудование для диализа.
Маленькие стерильные 'пробирки с крышками.
Среда Hepes-RPMI(H-RPMI), в некоторых случаях содержащая 2% СПК,
инактивированной нагреванием (H-RPMI - 2% СПК).
Хлорный хром: исходный раствор с концентрацией 1 мг/мл в физиологическом
растворе, pH 5,0, выдержанный не менее 1 мес ("созревший").
Стерильный физиологический раствор (ФР).
Белковый антиген с концентрацией не ниже 3 мг/мл.
Предыдущая << 1 .. 102 103 104 105 106 107 < 108 > 109 110 111 112 113 114 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed