Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 111

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 105 106 107 108 109 110 < 111 > 112 113 114 115 116 117 .. 122 >> Следующая

при непосредственной инкубации эритроцитов с культуральным фильтратом или
бактериальным экстрактом. Многие антибиотики .(в том числе пенициллин)
тоже обладают способностью к спонтанному связыванию с эритроцитами. Это
активный процесс, протекающий при 37 °С в течение 30- 60 мин.
262
Глава 7
Гаптенные группы присоединяются к поверхности эритроцитов при
непосредственной инкубации с активными производными ,(например, в случае
динитрофенцлового гаптена - с фтординитробензолом). Альтернативный подход
заключается в прикреплении гаптенов посредством молекулы ЛПС ,[22, 23].
6. Обратная реакция пассивной гемагглютинации с эритроцитами,
нагруженными антителами (ОРПГА)
6.1. Принцип
Антигены можно с 'большой чувствительностью (в том числе и количественно)
определить с помощью эритроцитов, нагруженных антителами, которые имеют
свободные антигенсвя-еывающие центры. Такие эритроциты могут
агглютинироваться антигеном в растворе. Для того чтобы агглютинация могла
произойти при непосредственном взаимодействии с антигеном, данный антиген
должен обладать достаточно сложной структурой и 'иметь несколько эпитопов
для антител, фиксированных на разных эритроцитах. В случае моноклональных
антител, связанных с эритроцитами, антиген должен обладать двумя
идентичными, но пространственно разобщенными эпитопами.
6.2. Связывание антител
Предназначенный для связывания иммуноглобулин должен (быть сравнительно
'чистым и в идеале состоять преимущественно из молекул специфических
антител. Это не представляет проблемы при использовании МКА, полученных
из асцитной жидкости и затем очищенных. В качестве препарата
поликлональных антител лучше всего использовать антитела, очищенные путем
аффинной хроматографии, или по краш ней мере фракцию иммуноглобулинов,
полученную с помощью (Ионообменной хроматографии (см. гл. 2, разд. 10).
Метод связывания с эритроцитами должен быть мягким, неденатурирующим,
поскольку специфическая антигенсвязывающая способность антител очень
лабильна. .Ниже приведены две наиболее распространенные и простые
методики.
6.2.1. Прямое связывание антител с ЭБ
1. Отмывают аликвоты (по 0,1 мл) фиксированных глута-ральдегидом или
пнруватным аль'дегидом эритроцитов барана и ресуспендируют их э (2 мл
>0,1 М ацетатного буфера, pH 5,0, содержащего 10-100 мкг антител.
Гемагглютинации и реакции антителозависимого гемолиза
263
2. После инкубации п'ри 37 °С в течение 2 ч с периодиче-, ским
перемешиванием клетки дважды отмывают, а затем ресуспендируют в 2 мл.PBS,
содержащего 0,1% азида и 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА).
6.2.2. Хлорный хром
Эта методика аналогична описанной для (белковых антигенов. Ей следует
отдать 'предпочтение в том случае, когда требуется максимальная
чувствительность теста. Эритроциты,, фиксированные диметидсуберимидатом,
тоже могут быть нагружены ,с помощью хлорного хрома [17], однако эта
методика обладает незначительными преимуществами. Она может
использоваться для количественного определения антигенов в в клеточных
.экстрактах, содержащих неионные детергенты, но если избыток детергента
удаляется при добавлении смолы, то можно Использовать и обычные
нефиксированные нагруженные антителами клетки [25].
6.3. Интерпретация результатов
При титровании антигенов в реакции обратной ПГА обычно наблюдается
выраженный эффект прозоны при высоких концентрациях антигена. Иногда
эффект может быть настолько сильным, что только в нескольких лунках в
середине панели для микротитрования наблюдается положительная реакция.
Вероятность указанного эффекта возрастает в том случае, если связанные с
/эритроцитами антитела обладают низкой аффинностью л.ибо недостаточно
хорошо очищены.
6.4. Технические замечания
1. В одностадийном тесте в лунках готовят последовательные разведения
антигена на среде H-RPMI - 2% СПК и ватем добавляют нагруженные
антителами эритроциты. Далее панели инкубируют. Конечной точкой
титрования антигена считают максимальное раз'ведение, дающее
положительную агглютинацию ,клеток. Тест используют как для выявления
антигена, так и для его количественного определения 'против стандартных
разведений.
2. Можно осуществить и вторую стадию - как в случае обычной ПГА - путем
простого отмывания клеток с последующим добавлением в суспензию вторых
антител. Очевидно, что вторые антитела должны быть направлены к тем
детерминантам антигена, которые остаются доступными после "захвата"
антигена Связанными с эритроцитами антителами. Ес-
264
Глава 7
ли как на первой, так и на второй ста'дии используют моноклональные
антитела, то они должны быть на'правлены к пространственно отдаленным
друг от друга эпитопам.
3. Другой способ, 'применяемый особенно в тех случаях, (когда
исследователь имеет дело с моновалентными антигенами,- это
иопольз'ован'ие для титрования смеси нагруженных /антителами эритроцитов,
причем антитела каждого типа должны быть специфичны по отношению /к
пространственно разобщенным детерминантам -[24]. Иногда лучше проводить
Предыдущая << 1 .. 105 106 107 108 109 110 < 111 > 112 113 114 115 116 117 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed