Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 110

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 104 105 106 107 108 109 < 110 > 111 112 113 114 115 116 .. 122 >> Следующая

целый ряд объемов хлорного хрома (0,4-1,2 мл). Выбирают ту наибольшую
дозу, которая еще не дает неспецифической агглютинации (отрицательная
"картина осаждения" эритроцитов). Такие объемы хлорного хрома используют
в будущих экспериментах.
5.3. Реакция пассивной гемагглютинации с эритроцитами, нагруженными
белковым антигеном
5.3.1. Принцип
Пассивная гемагглютинация осуществляется таким же образом, как и
титрование антител к собственным антигенам эритроцитов. При этом
используют серию последовательных разведений антител в рядах панели для
микротитрования, добавляя нагруженные антигеном эритроциты и определяя
титр антител 'путем оценки "картины осаждения" эритроцитов через
несколько часов после их добавления. Вторую стадию, •когда добавляют
антиглобулин, можно проводить согласно методике, описанной в разд. 4.1.
17*
260
Глава 7
5.3.2. Постановка реакции
1. Готовят последовательные разведения мышиных моноклональных антител
(МКА) к х-цепи иммуноглобулина человека в 50 мкл среды H-RPMI - 2% СПК.
2. В каждую лунку с антителами, а также в контрольные лунки, содержащие
лишь 50 мкл среды для разбавления, добавляют по 50 мкл 0,5%-ной ((объем
на объем) суспензии нагруженных антигеном эритроцитов барана (в качестве
антигена используют IgG" или свободные х-цепи IgG).
3. Через 2 ,ч определяют прямой титр пассивной гемагглю-тинации. Конечной
точкой титрования считается последняя лунка ряда, в (которой еще
наблюдается гемагглютинация. ,
4. Панель осторожно центрифугируют (разд. 4.1), супернатанты удаляют,
промывают клетки, добавляя 'по 100 мкл среды. Для разведения и снова
центрифугируют. После удаления супернатантов в каждую лунку добавляют по
100 мкл иммуноглобулина барана к антителам мыши в разведении 1 : 100.
Клетки ресуспендируют пипетированиам, начиная с той лунки, где антитела
максимально разведены. Через два часа определяют титр непрямой пассивной
гемагглютинации.
5.3.3. Интерпретация результатов
Положительный результат в прямом титровании свидетельствует о способности
антител и к связыванию с антигеном, и к перекрестному связыванию, в то
время как на второй стадии выявляют антитела, способные к прочному
связыванию с антигеном, но не к эффективному перекрестному связыванию.
Таким образом двухстадийное титрование аналогично другим методам, таким
как ELISA или ИРМА. Разница заключается в том, что в случае
двухстадийного титрования антиген сохраняет свое нативное состояние
(например, он не денатурируется при связывании с поверхностью пластика).
5.3.4. Технические замечания
1. В связи с высокой чувствительностью метода для полной раститровки
антисыворотки могут потребоваться два ряда лунок; во избежание этого в
первую лунку можно помещать разбавленную антиаыворотку.
2. Нагруженные антигеном эритроциты имеют тенденцию к спонтанной
агглютинации, которую можно предотвратить, используя для приготовления
разведений /богатую белками среду. .Идеальная среда - это СПК, (поскольку
она не содержит иммуноглобулинов. Однако необходимо удостовериться в том,
Гемагглютинация и реакции антителозависимого гемолиза
261
что СПК действительно имеет фетальное происхождение. Кроме того,
содержащийся в ней комплемент необходимо инактивировать нагреванием.
3. При осуществлении титрования на второй стадии в присутствии
антиглобулина необходимо исключить наличие в нем антиэритроцитарных
антител. При использовании иммуноглобулиновых антигенов следует убедиться
в отсутствии реакции с молекулами Ig, которыми сенсибилизировали
эритроциты.
4. Необходимо поставить следующие контроли:
а) среда для разведения и нагруженные антигеном эритроциты;
б) положительная сыворотка и эритроциты, не нагруженные антигеном;
в) нормальная (неиммунная) сыворотка и эритроциты, нагруженные антигеном;
г) антиглоб'улиновый реагент и эритроциты, нагруженные антигеном ((при
постановке непрямой пассивной гемагглютинации).
5.4. Реакция пассивной гемагглютинации с эритроцитами, нагруженными
полисахаридами и гаптенами
В целом полисахариды не могут быть связаны с эритроцитами спонтанно или
при помощи таких реагентов, как хлорный хром или таннин. Известны два
способа связывания этих антигенов (см. также гл. 2, разд. 3.1.2).
1. Периодатное окисление некоторых групп сахаров с образованием
альдегидов, которые в свою очередь ковалентно связываются с аминогруппами
на поверхности эритроцитов [19, 20].
2. Прикрепление к полисахариду жирной кислоты с длинной цепью, например
стеариновой. Липофильная часть такой молекулы приобретает способность
прочно встраиваться в мембрану эритроцитов при 37 °С. Прикрепившиеся
полисахариды экспонируются на поверхности эритроцитов [21]. Ф акти-чески
существуют и многочисленные природные ли'пополиса-хариды (ЛПС) такого
типа, продуцируемые бактериями (например, ЛПС грамотрицательных
микроорганизмов, производные тейхоевой кислоты, образуемые стрептококками
и стафилококками). Связывание эритроцитов с та'кими антигенами происходит
Предыдущая << 1 .. 104 105 106 107 108 109 < 110 > 111 112 113 114 115 116 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed