Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка):
такую .реакцию >в две стадии: на первой стад'ии может .быть нспользоНан
реагент, представляющий собой связанные с эритроцитами антитела к
свободным A-цепям. Цель этой стадии заключается |в отборе из р'ме'си
свободных и связанных с тяжелыми де'пями Я-цепей только свободных Я-
це'пей. После отмывания клетки ресуспендируют и смешивают с эритроцитами,
нагруженными антителами, которые реагируют как со свободными, так и со
связанными антителами Я-цепями.
7. Реакция торможения гемагглютинация (РТГAJ
7.1. Принцип
Агглютинация нагруженных антигенами эритроцитов с помощью антител в
концентрации, слегка превышающей их минимальную агглютинирующую дозу
(МАД), легко ингибируется неболыним'и количествами того же антигена (в
растворе. (Основанная на этом делении тест-система включает в себя два
последовательных титрования. Дервое Титрование антител осуществляют путем
,их последовательных разведений для определения /примерного значения МАД.
Второе (же титрование, которое начинают с концентрации, составляющей
примерно 4 МАД, необходимо для более точного определения титра. Пробное
ингибирование (торможение) агглютинации стандартным антигеном .затем
проводят с использованием антител в количестве ,2 единиц МАД. Цель
заключается ,в достижении заметного торможения гемагглютинация,
выражающегося в отсутствии агглютинации под влиянием антигена,
разведенного до следовых количеств, в лунках, следующих за лунками с
выраженной агглютинацией. Этот переход и представляет собой конечную
точку титрования антигена. Пробы затем могут быть протестированы на
присутствие антигена в растворе. Антиген определяют количественно по
разведению путем сравнения его титра с титром стандарта.
7.2. Постановка реакции
1. Готовят нагруженные антигеном эритроциты, как описано в разд. 5.2.
Гемагглютинации и реакции антителозависимого гемолиза
265
2. Проводят две предварительные реакции агглютинации '(определение
приблизительного и точного титра антител), используя 0,5%-ную суспензию
нагруженных антигеном эритроцитов и среду .H-RPMI- 2% *СПК. По
результатам второй реакции определяют разведение антител, содержащее 2
МАД при использований 0,5%-ной суспензии эритроцитов. Готовят
определенный объем раствора антител в этом разведении.
3. Торможение стандартным раствором антигена. Вносят по 50 мкл среды для
разведения в лунки трех рядов панели для ми.кротитрования. (С помощью
летли для приготовления разведений добавляют 50 м^кл антигена в первую
лунку 'ряда А и последовательно разводят его в д(вух рйдах панели. Если
исходная концентрация антигена составляет 1 мг/мл, тс в последнем
разведении она должна составлять менее 100 пкг/мл. Добавляют в лунки по
50 мкл нагруженных антигеном эритроцитов, перемешивают, накрывают панели
крышкой. Через 1-2 ч оценивают результаты по 'Характеру оседания
эритроцитов. Третий ряд луноК используют для постановки контролей. Они
должны включать в себя нагруженные антигеном эритроциты (без антител),
антиген в растворе и нагруженные эритроциты и антитела (без антигена в
растворе).
4. Постановка реакции. Разводят в лунках "панели параллельно стандарт д
тестируемые антигены. Количество разведений стандартного антигена можно
уменьшить, -с тем чтобы конечная точка титрования находилась в пределах
одного ряда панели. Для раститровки исследуемых антигенов могут
понадобиться два ряда панели. "Контроли должны включать в себя
исследуемые антигены с нагруженными и ненагруженны-ми эритроцитами, а
также нагруженные эритроциты с антителами без антигена.
7.3. Технические замечания
1. РТГА часто пред'почитают ПГА как метод количественного определения
антигена. Он обладает рядом преимуществ. •Так, напрцмер, нет
необходимости ,в получении очищенных андител из' антисыворотки ил'и
асцитной (Жидкости; антиген может быть мономерным да использоваться в
реакции в натив-,ном состоянии.
2. Описанный метод иногда может давать превосходные результаты. Неудача,
как правило, связана с низкой аффинностью антител, которые вследствие
этого преимущественно связываются с 'повторяющимися антигенными
детерминантами на 'поверхности эритроцитов, а не со свободным антигеном.
3. Полезная модификация РТГА для изучения аллотипи-ческих маркеров
иммуноглобулинов животных соединяет в
266
Глава 7
себе принципы антиглобулинового теста и ингибирования. Днтитела ik (ЭБ
могут использоваться для сенсибилизации клеток в субагглютинирующих
дозах, в результате чего антиал-лоти'пические сыворотки вызывают
агглютинацию. Эту реакцию можно ингибировать свободным;" аллогипами. -
Жи1вот-ных, гомозиготных по известным аллотипам, можно легко
иммунизировать эритроцитами для того, чтобы получить чувствительные
антиаллотипические антитела. Такую стратегию успешно применяли для
титрования аллотипических локусов кролика в не'преци'питируюп^их
системах. В одном из методов неагглютинирующие 'изоантитела к кроличьим
зритроцитар-Н1ым аллельным антигенам использовались для сенсибилиз'а-дии
