Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 106

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 100 101 102 103 104 105 < 106 > 107 108 109 110 111 112 .. 122 >> Следующая

Добавляют в каждую пробирку по 1 мл ледяного БГР и* .перемешивают.
Содержимое пробирок центрифугируют три 200 g в течение 10 мин, после чего
измеряют оптическую плотность супернатантов при 413 нм.
3. Строят кривую зависимости лиаиса . j(b процентах) /от объема
добавленного комплемента. За 100%-Н1ЫЙ лизис принимают значение,
.полученное в девятой контрольной пробирке. В результате должна
получиться сигмовидная кривая. С ее помощью определяют объем
ко'мплемента, необходимый для 50%-норо лиаиса дСН50). Исходя из этого
значения, рассчитывают то разведение комплемента, рри котором "в 50 мкл
содержится 1 е'диница СН50. Такое разведение комплемента необходимо для
титрования антител с использованием 50 мкл 1%-ной .суспензии ЭБ. Затем
рассчитывают разведение комплемента, при котором в 50 'мкл содержится 4
единицы СН50> г. е. стандартный избыток.
Гемагглютинация и реакции антителозависимого гемолиза
251
Таблица 7.1. Титрование комплемента
Номер пробирки
БГР (мл) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 (контроль)
1,20 1,15 1,10 1,05 1,00 0,90 0,80 0,70 1,20 (аммиак)
Комплемент (1 : 30/мл) 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,30 0,40 0,50 0,00
1%-ная взвесь эритроцитов, нагруженных 1 МГДА (мл) 0,30 0,30 0,30 0,30
0,30 0,30 0,30 0,30 0,30
Лизис 4- + +¦+ -|-Ь 4- ++ + -1-ь ++ ++ ++ ++ (100%)
++
3.3.5. Технические замечания
1. Можно использовать коммерческий препарат .консервированного
ком'племента морской свинки ,(см. приложение). Такой ком'племент
разводят, если это необходимо, и хранят в соответствии с (Прилагаемой
инструкцией. Обычно использу-ют неразбавленный комплемент.
2. Свежую сыворотку морской свинки получают из свернувшейся крови, взятой
путем пункции сердца (см. гл. \2, разд. i5.2.3) в стерильных .условиях с
обеспечением минимального гемолиза. Сыворотку как можно скорее осторожно
отделяют от сгустка крови и центрифугируют при 200 g для осаждения
оставшимися эритроцитов. (Комплемент не теряет активности в сыворотке,
(Хранимой в ,виде небольших алийвот при -70 °С.
¦ 3. При титровании исходное 'разведение ком'племента
должно соответствовать разведению, вызывающему минимальный лизис во
второй пробирке. На практи'ке, ка'к правило, оказывается, что разведение
,1:30 в .БГР, полученное из разбавленного в соотношении 1 :3 истощенного
комплемента, близко к оптимальному. В любом случае следует, однако,
подбирать исходное разведение в соответствии с полученными
(экспериментальными результатами.
3.4. Реакция антителозависимого гемолиза
3.4.1. Сравнение гемолитических и гемагглютинационных титров
сывороток
1. Маркируют панель для микротитроваНия, как опНсано (в разд. 2. В
каждую лунку вносят по 50 м'кл БГР.
252
Глава 7
2. С помощью специальных петель (на 50 мкл) готовят один ряд , разведений
нормальной кроличьей сыворотки <(ряд А), а 'под ним - двойные ряды
разведений исследуемых сывороток.
| 3. Добавляют /в од'ин из двух рядов для каждой исследуе-
мой сыворотки ,по 50 м'кл БГР (вместо комплемента), а в остальные ,ряды -
по i50 м:кл разведения комплемента, содержащего 4 едикицц^СНбо (согласно
определению, [Приведенному в разд. 3.3).
4. Добавляют во все .лункю по 50 мкл 1%-ной суспензии ЭБ, у.
5. Перемешивают содержимое лунок легким постукиванием по панели, затем
накрывают ее крышкой и инкубируют при 37 °С в течение 1-2 ,ч. Для оценки
литической реакции в-лунках панель следует рассматривать над белым фоном.
Гемолитический титр определяют как .последнее разведение, Дающее по'лный
лизис (т. е. отсутствуют иитактиые (Эритроциты, осевшие на дно лунки).
Более точные результаты можно подучить /при .использовании 'панелей с U-
образными лунками. !В лун'ках ряда Н ('Контроль- без сыворотки) не должно
наблюдаться .лизиса или агглютинации. В лунках ряда А (контроль- с
нормальной сывороткой) могут наблюдаться агглютинация и лизис
(частичные), что связано с наличием гетерофильных антител.,
3.4.2. Сравнение гемолитических титров IgM и IgG с помощью 2-
меркаптоэтанопа
Стадии -(1) и'(2) аналогичны таковым, описанным ,в разд. 3.4.1.
3. JB лунки одного из двух парных рядов для каждой .исследуемой сыворотки
^вносят по 50 мкл БГР (вместо 2-МЭ), а во все остальные ряды ((в вытяжном
игкафу) - по 50 мкл 2-МЭ. Накрывают панель крышкой и оставляют на 30 мин
на столе.
4. Во все лунки добавляют 50 мкл комплемента (4СН50), а затем 50 мкл 1 %-
ной суспензии ЭБ. Перемешивают, накрывают панель к'рышкой и инкубируют,
как описано выше.
i 5. .Интерпретация результатов; на рис. 7.2 (ряды D и Е) шредставлени
результаты гемолитического теста с предварительной обработкой :сыворот(ки
2-МЭ (ряд Е) и без таковой (ряд D) (в этом случае с использованием 2%-ной
суспензии ЭБ). Эффект обработки ^-меркайтоэтанолом проявляется в снижении
геополитического титра на 3 ступени1 (т. е. при ,последовательных
разведениях 1:2, как в данном случае, в 8 раз).
Гемагглютинации и реакции аитителозависимого гемолиза
25"
4. Антиглобулиновые тесты (тесты Кумбса)
4.1. Определение неагглютинирующих антител
Предыдущая << 1 .. 100 101 102 103 104 105 < 106 > 107 108 109 110 111 112 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed