Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 105

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 99 100 101 102 103 104 < 105 > 106 107 108 109 110 111 .. 122 >> Следующая

.стандартных условиях. К фактора*м, влияющим на лизис, относятся
концентрация эритроцитов, концентрация антител, связанных с эритроцитами,
тип ,буфера и температура. Поэтому величина СН50 в известной степени
произвольна; она зависит от условий постановки теста.
3.3.2. Получение ЭБ, нагруженных антителами
1. Инактивируют комплемент кроличьей сыворотки к ЭБ (1 мл), содержащий
большое количество IgM, нагреванием в водяной бане при 56 °С в течение 30
мин.
2. Титруют сыворотку путем агглютинации 1%-ной (объем на объем) суспензии
ЭБ (разд. 2) в БГР.
3. Рассчитывают объем этой сыворотки, необходимый для связывания с 10 мл
6%-ной (объем на объем) суспензии ЭБ в первом субагглютинирующем1
разведении, а также объемы, необходимые для получения разведений
эритроцитарной суспензии на одну сту'пень выше и на одну ступень ниже
этой концентрации. Добавляют три рассчитанных таким образом объема
сыворотки в три флакона, содержащие по 10 мл 6%-ной суспензии эритроцитов
в БГР ('предварительно тщательно отмытых в БГР), хорошо перемешивают и
помещают флаконы на ротационный встряхиватель (либо же /Вручную
интенсивно перемешивают содержимое флаконов) при 37 °С на 30 мин.
Полученную суспензию эритроцитов хранят при 4°С; ее можно использовать в
течение 24 ч.
3.3.3. Тестирование не адекватное связывание антитэп с поверхностью
эритроцитов (см. рис. 7.3]
1. Пробирку, в которую внесли 1 мл комплемента, помещают в ледяную
баню '(0°С), добавляют 2 мл ледяного ФР и 0,3 мл осад'ка эритроцитов,
промытых в холодном ФР. Пере-
Гемагглютииация и реакции антителозависимого гемолиза
249
Рис. 7.3. Определение минимальной гемолитической дозы антител путем
титрования комплемента с помощью нагруженных гемолитическими антителами
эритроцитов в трех различных концентрациях (серии двойных разведений) в
последующих сдвоенных рядах: А и В, С и D. Е и F. Комплемент добавлен в
разведении 1 : 3 в вертикальный ряд 1 и последовательно разведен (1:2) в
первом ряду каждой пары. Второй ряд каждой пары представляет собой
контроль (только БГР) на отсутствие спонтанного лизиса или агглютинации.
Эритроциты, перегруженные антителами (ряды А и В), спонтанно лизируются
во время инкубации. Эритроциты, несущие на поверхности половину этого
количества антител (ряды Си D), подвергаются опосредованному комплементом
лизису вплоть до разведения комплемента 1 : 192, но с очевидной
спонтанной (ауто) агглютинацией сенсибилизированных эритроцитов. Снижение
концентрации антител на поверхности эритроцитов на следующей ступени
разведения дает чувствительную гемолитическую систему без аутолизиса или
аутоагглютинации. Это количество антител можно использовать в дальнейшем
для приготовления индикаторных лизируемых клеток в целях постановки
реакции связывания комп
лемеита (разд. 8).
мешивают содержимое пробирки и оставляют ее на 1 ч при 0°С, для того
чтобы истощить комплемент эритроцитами, т. е. удалить из него
антиэритроцитарные антитела, (в условиях, исключающих гемолиз. Зате'м
суспензию ЭБ центрифугируют при 200 g и 4 °С в течение 10 мин. Истощенный
компле-1мент собирают-теперь он разбавлен в соотношении 1:3
физиологическим раст'вором.
2. Из каждой пробы нагруженных антителами ЭБ (см. разд. 3.3.2, стадия 3)
отбирают небольшую аликвоту и разбавляют ее до получения 1 %-ной ,(объем
на объем) суСпензии в БГР.
3. В три пары рядов панели для микротитрования вносят по 50 мкл БГР и
затем в каждой паре рядов оттитровывают
250
Глава 7
истощенный комплемент, используя для приготовления разведений специальные
петли на 50 мкл. В .последние три ,лунки второго ряда ,каждой пары вместо
.разведений комплемента добавляют долька БГР. Затем в каждую лунку вносят
па 50 мкл 1%-ной суспензии нагруженных антителами ЭБ, причем для каждой
пары рядов панели используют один -из трех имеющихся в распоряжении
препаратов эритроцитарной сус-'пензии. Содержимое лунок перемешивают
осторожным постукиванием по панели, закрывают ее крышкой и оставляют на
1-2 ч при 37 °С, При оптимальной концентрации связанных с эритроцитами
антител наблюдается л|изис вдоль всего ряда лунок. Таким образом
определяют минимальную гемолитическую дозу антител ^(МГДА). Иногда для
'получения результата необходимо специально подобрать концентрацию
нагруженных на поверхность эритроцитов антител, а также исходное
разведение истощенного комдлемента. Связывание,с эритроцитами слишком
большого количества антител может привести к независимому от комплемента
(спонтанному) лизису эритроцитов, как показано на рис. 7.3.
3.3.4. Титрование образца истощенного комплемента: СН50
1. Последовательные разведения истощенного ком'племен-та смешивают со
стандартной .суспензией эритроцитов,, нагруженных. 1 МГДА, в пробирках
согласно схеме, приведенной в табл. 7.1. Исходное разведение комплемента
(в БГР) должно .составлять примерно 1 :30 |(см. разд. 3.3.5, стадия 3). .
2. Пробирки закрывают и инкубируют 2 ч при 37 °С, периодически
переМешив'ая .содержимое, а затем помещают (на 30 мин в ледяную баню.
Предыдущая << 1 .. 99 100 101 102 103 104 < 105 > 106 107 108 109 110 111 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed