Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 107

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 101 102 103 104 105 106 < 107 > 108 109 110 111 112 113 .. 122 >> Следующая

4.1.1. Принцип
IgG к антигенам :клеточной поверхности, экспонированным на ней в низкой
плотности .либо слабо выявляемым, иногда 'проявляют свойства
моновалентных антител. Это обусловлено прежде всего их неспособностью
формировать стабильные перекрестные связи. К такому типу, например,
относятся IgG jK резус-антигену. Однако связывание моновалентных антите'л
с клетками можно выявить с помощью антиглобулинового-реагента.
Разумеется, необходимо тщательно .обмыть несвя-давшиеся иммуноглобулины
сыворотки, участвующие в 'первой стадии реакции, которые р противном
случае .могли бы конкурировать со Связавшимися молекулами
иммуноглобулинов 1за антиглобулин.
4.1.2. Необходимое оборудование и реагенты
Низкоскоростная центрифуга со специальными держателями для
центрифугирования панелей.
Пастеровские .пипетки с вытянутыми тонкими кончиками. Антиглобулиновые
реагенты: анти-IgM, анти-IgG, или антитела со смешанной специфичностью,
истощенные эритроцитами барана (см. разд. 3.3, стадия 1).
4.1.3. Постановка реакции
Титрование можно проводить -в панелях или пробирках. Методика определения
резус-аНтител пробирочным методом приведена в кн. 2. При использовании
панелей для центрифугирования необходимо применять специальные держатели
(только в некоторых типах центрифуг). Непродолжительное центрифугирование
при низких скоростях (достаточных для осаждения эритроцитов)-это все, что
необходимо для постановки реакции. Супернатант отсасывают с 'помощью
вытянутой пастеровской ,'пипетки. Клетки промывают один раз и PBS, снова
центрифугирую'т, а затем тщательно ресуспендируют в 100-200 мкл
разбавленного (-примерно 1 : 100) антиглобулина. Перемешивают
последовательным пипетированием, начиная с Дунок с максимальным
разведением антител. После осаждения 'млеток Определяют титр.
254
Глава 7
4.2. Титрование антиглобулина с помощью предварительно
сенсибилизированных клеток
4.2.1. Принцип
Описанная ниже методика представляет собой простой и эффективный способ
титрования антиглобулиновых реагентов (анти-IgM или анти-IgG, а также
антиглобулинов смешанной с'ггецифичности). Необходимость в таком
титровании возникает, например, при стандартизации пробы Кумбса или при
сравнении антиглобулиновых титров сыворотки для оценки ее качества. При
этом используют эритроциты, предварительно нагруженные субагглютинирующей
дозой специфических антител. IgM и IgG можно разделить хроматографическим
'путем, как описано в гл. 2 (разд. 3.2.3), а затем использовать для
сенсибилизаций клеток.
422. Постановка реакции
Эритроциты можно сенсибилизировать' антителами, как ¦описано в разд.
3.3.2. Используя для связывания с эритроцитами три концентрации антител,
обычно можно с перйого раза определить дозу, дающую крайне чувствительный
анти-глобулиновый тест, .без какой-либо тенденции к спонтанной
агглютинации. Однако в том случае, если эритроциты, нагруженные
антиг'лобулинами в оптимальной концентрации, все же проявляют склонность
ik образованию конгломератов в безбелковом буфере, можно рекомендовать
проводить тест с использованием буфера, содержащего .2% инактивированной
нагреванием сыворотки .плода коровы (СПК). Постановка реакции аналогична
таковой в случае прямой гемагглютинации, однако в связи с ее вмеокой
чувствительностью для определения конечной точки титрования возможно
'придется титровать антиглобулины в разведениях, превышающих 24-луночные
серии, либо же начинать титрование с разведения 1 :1000. Для достижения
максимальной чувствительности можно использовать 0,5%-ную суспензию
сенсибилизированных клеток.
Необходимы следующие контроли:
1. Нагруженные антителами эритроциты (суспензия в буфере).
2. Нормальная сыворотка (от того же вида животного, от которого получают
антиглобулины) с нагруженными эритроцитами.
3. Антиглобулин с ненагруженными эритроцитами.
4.2.3. Другие области применения
Тест Кумбса можно применять для оценки чистоты препаратов IgM и IgG
(сенсибилизирующих эритроциты), используемых для приготовления
антиг'лобулиновых реагентов (см.
Гемагглютииация и реакции антнтелозависимого гемолиза
255
гл. 2, разд. 3.2.3). В пассивных тестах с использованием нагруженных
антигеном эритроцитов 'изотипспецифические антитела могут применяться для
исследования распределения изотипов неагглюти'нирующих антител первой
стадии или же других антител, разбавленных до субагглютинирующей
концентрации.
5. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) с использованием
нагруженных антигеном эритроцитов
5.1. Сравнение различных методов связывания антигена с эритроцитами
Одним из наиболее давно применяемых агентов для связывания антигенов с
эритроцитами служит бис-диазобензидин (БДБ). Использование этого и других
реагентов освещено в литературе [6]. БДБ (представляет собой (молекулу с
двумя, активными диазогруплами, которые теоретически могут связываться с
тирозильными или имидазольными группами клеточной поверхности, с одной
стороны, и с аналогичными группами растворимого антигена, с другой. Такой
Предыдущая << 1 .. 101 102 103 104 105 106 < 107 > 108 109 110 111 112 113 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed