Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 113

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 107 108 109 110 111 112 < 113 > 114 115 116 117 118 119 .. 122 >> Следующая

кроличьих эритроцитов /[26].
8. Реакция связывания комплемента (РСК)
8.1. Принцип
Образование комплексов антиген - антитело in vitro можно регистрировать
путем количественного определения йвязы-ваИия (потребления) /комплемента,
добавленного извне в стандартном, ограниченном количестве. Собственный
комп-¦лймент, содержащийся в исследуемых сыворотках, инактивируют путем
их предварительного нагревания. ,Успех тестирования в решающей степени
зависит от наличия комплемент-с!вязывающих изотипов антител, однако
реакция может использоваться для выявления как антител, так и антигена.
8.2. Общая схема постановки реакции
Стандартный раствор антигена и инактивированные комп-лемент-связывающие
контрольные антитела разводят (в виде смеси) д ходе двойной раститровжи
антигена против антител '.(па принципу "шахматной доски"), 3 лункой
'вносят .лимитирующее количество активного., комплемента. Если комплемент
связывается, то он уже не способен вызывать комплемент-зависи!мкй лизис
Загруженных антителами эритроцитов, которые добавляют в лунки в качестве
индикаторной системы для выявления несвязывавшегося комплемента. В той
части панели, где наблюдается заметный переход от отсутствия лизиса к
полному лизису, выявляют те концентрации антигена и антител, которые
можно воспроизвести в условиях реакции для их количественного
определения.
Стадии проведения реакции описаны ниже:
1. Готовят гемолитическую индикаторную систему из сен-еибилизированнщ
эритроцитов и, определенной дозы комп-
Гемагглютинация и реакции антителозависимого гемолиза
267
лемента. Антитела рекомендуется использовать в количестве 6 единиц МДГА,
а комплемент -4 единицы СН50. Процедуры /титрования, необходимые для
определения этих концентраций антител и комплемента, а также
приготовление сенсибилизированных эритроцитов ,и истощенного эритроцитами
комплемента описаны в разд. 3.3.1-3.3.4.
I 2. Проводят двойную граститровку антигена и а,нтител с добавлением
комплемента.
3. Добавляют гемолитический индикатор и определяют чувствительную
конечную зону (зону титра) для последующего использования полученных
данных в тест-системе.
8.3. Подробное описание реакции
8.3.1. Двойное ("шахмвтное"] титрование
1. Прогревают антисыворотку при 56 °С в течение 30 мин для инактивации
содержащегося в ней комплемента. Во все лунки панели вносят шо/50 мкл БГР
(см. разд. 3.2). .Затем проводят двойную (параллельную) раститровку
антител во всех восьми рядах (А-Н) вплоть до вертикального ряда II
(1:2048). Вертикальный ряд 12 оставляют свободным от антител в качестве
контроля ;(добавляют только антиген).
2. В семи стекля'нных пробирках ,на/2 мл, помеченных соответственно В-Н,
..готовят по 1 мл разведения антигена в (БГР, причем последовательные
раз'ведения должны быть Кратны 2. Вносят по j&0 мкл разведения Д
(максимальная концентрация) (r) каждую лунку ряда В; повторяют то же для
/С-Н. ;Ряд А оставляют свободным от антигена ш качестве контроля -
(добавляют только антитела).
3. (В каждую ;лунКу панели вносят шо *50 мкл истощенного комшле'мента,
содержащего 4 единицы СН50, перемешивают; накрывают панель крышкой и -
оставляют на ночь (16 <ч)*' при 4 °С.
8.3.2. Стадия лизиса
На следующее утро панель инкубируют в течение 30 мин ¦при 37°С, а затем
добавляют по 50 мкл 0,5%-ной взвеси сенсибилизированных антителами /(6
МДГА) эритроцитов, перемешивают, накрывают .панель крышкой и снова
инкубируют -при 37 °С в течение 60 мин либо до- наступления гемолиза.
8.3.3. Интерпретация результатов
При соответствующих разведениях антигена и антител в "шахматной"
раститровке зона в верхнем левом углу панели, где реагирующие компоненты
находятся в максимальной
268
Глава 7
концентрации, представляет собой зону минимального или нулевого
/ге1молиза, поскольку в этих условиях связывается ¦максимальное
количество комплемента. Для достижения такого результата необходимо
предварительно правильно подобрать концентрации реагентов.
Высокий уровень гемолиза должен наблюдаться в контрольных лунках, где
находится только антиген или только антитела (вертикальный ряд 12 и ряд
А), а также в лунках, где антиген и антитела слишком разбавлены и поэтому
не способны к образованию значительного числа ком-племент-ювязывающих
комплексов [(направление на панели соответственно вниз и направо). В
лунках центральной области панели должно происходить связывание
комплемента, приче'м выявляется зона, состоящая из лунок с минимальным
лизисом; Эта зона дает информацию о правильных соотношениях антигена и
антител, которая необходима для последующего 'тестирования реагентов с
неизвестными параметрами в условиях максимальной чувствительности.
8.3.4. Тестирование сывороток или антигенов
Условия выбираются на основании результатов двойного ("шахматного")
титрования. Раститровку тестируемых реагентов осуществляют в одиночных
рядах. Используют либо стандартную концентрацию антигена, либо
стандартное разведение антител, изменяя при этом концентрацию второго
Предыдущая << 1 .. 107 108 109 110 111 112 < 113 > 114 115 116 117 118 119 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed