Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка):
нагруженные растворимым антигеном (для постановки реакции пассив'ной
гемагглютинации), шоверхностный заряд зачастую уменьшается, и вследствие
этого появляется возможность спонтанной агглютинации. Эту .проблему можно
решить, применяя для приготовления разведений раствор, содержащий белок.
При постановке прямых реакций в этом, как правило, нет необходимости.
3. Реакции антителозависимого гемолиза и титрование комплемента
3.1. Принцип
Комплемент представляет собой многокомпонентную систему белков, обычно
присутствующих в сыворотке в неактивном состоянии. Если первый компонент
комплемента активируется при связывании с комплексом антиген - антитело
(антитела должны обладать комплемент-связывающей активностью), то он
приобретает способность активировать молекулы следующего компонента,
давая начало каскадной ферментативной реакции, кульминацией которой
является лизис.
216
Глава 7
если мишенями служат чувствительные клетки, например эритроциты. Если
антитела к антигенам эритроцитов разбавляются избытком комплемента, то
конечная точка титрования, определяемая по гемолизу, может служить мерой
активности препарата антител. Поскольку комплемент сыворот'ки нестабилен
при хранении, точность титрования зависит от использования
количественного избытка комплемента из ^внешнего источнйка
.(консервированной или свежей сыворотки морской свинки). Остаточную
активность комплемента в. исследуемых сыворотках элиминируют путем
предварительного прогревания сывороток. Это помогает обеспечивать стан-
дартизуемость теста. Для количественного определения добавленного
комплемента его титруют в гемолитической системе эритроцитов (эритроциты,
нагруженные антиэритроцита'р-ными антителами) после предварительного
истощения сыворотки морской свинки для удаления содержащихся в ней
антител к эри'троцитам. (Титрование гемолизинов осуществляют следующим
образом:
1. Получают нагруженные антителами эритроциты для титрования комплемента.
2. Тестируют адекватное связывание антител с эритроцитами путем лизиса в
избытке комплемента.
3. Истощают комплемент эритроцитами в физиологическом растворе на холоду.
4. Титруют комплемент в литической индикаторной системе для определения
разведения, .дающего 50%-ный лизис-,(СН50). Для титрования исследуемых
антител затем используют разведение комплемента, дающее 4 СНбо-единицы
(стандартный избыток).
5. Ина'ктивируют комплект, прогревая исследуемые сыворотки.
I 6. Титруют исследуемые сыворотки (например, к ЭБ в. прямом тесте) с
использованием стандартного избытка комплемента.
3.2. Материалы и реагенты (дополнение к разд. 2.1; см. приложение)
Буфер для гемолитических реакций (БГР)
Исходный раствор А:' 85 г NaCl
2,75 ,г барбитурата натрия.
Раст'воряют в 1400 мл дистиллированной воды
Исходный раствор В: 5,75 г диэтилбарбитуровой кислоты,.
растворенной в (500 мл горячей дистиллированной воды
Гемагглютинация и реакции аитителозависимого гемолиза
247
Исходный раствор С: 20,3 г MgCl2-6H20 (2 М), растворенного в 50 мл
дистиллированной воды
Добавляют 30 мл .1 ,М раствора СаС12
Доводят объем раствора до 100 мл. Конечные концентрации: 1 MMgCl2
0,ЗМ СаС12
1. Смешивают растворы А и В и охлаждают до комнатной температуры. ,
2. Добавляют 5 мл. раствора С.
3. Доводят объем дистиллированной водой до двух литров и хранят раствор
при 4 °С (исходный раствор .БГР).
;4. Рабочий раствор БГР: к одной части исходного раствора БГР добавляют
четыре части дистиллированной воды.
Физиологический ¦ 1 рас- 0,9%-ный (вес на объем)
твор (ФР): раствор NaCl в дистиллиро-
ванной воде стерилизуют в бутылях из термостойкого стекла
автоклавировани^м
Кроличья рнтисыворотка к? Для приготовления зффе'к-
ЭБ: тивной гемолитической системы титрования компле-
мента необходимо отбирать кровь в ходе 'первичного иммунного ответа.
Пробы, отобранные после повторной иммунизации, можно использовать для
определения гемолитических титров ,IgG и IgM Консервированный
(коммерческий) .препарат или свеже-полученная сыворотка морской свинки
0,04%-ный раствор в дистиллированной воде (или 10%-ный сапонин)
Водяная баня на 56 °С.
Спектрофотометр.
Ротационный встряхиватель (в теплой комнате или термостате на 37 °С).
Емкость для льда.
Стеклянные пробир/ки |(2 мл) и штатив для пробирок.
Градуированные пипетки (2 мл) или автоматические пипетки (2 мл) с
варьируемым рабочим объемом, снабженные наконечниками.
Комплемент:
Раствор аммиака:
243
Глава 7
Универсальные стеклянные флаконы (20 мл).
Мерный цилиндр (100 мл).
3.3. Титрование комплемента морской свинки
3.3.1. Принцип
Нагруженные антителами эритроциты добавляют к разведениям комплемента в
пробирках. /Степень лизиса регистрируют спактрофотометрически, сравнивая
его с .поглощением гемоглобина в пробах с полным лизисом клеток. Лизис
приближается (К 100% по сигмовидной кривой (асимптотически), поэтому
трудно определить величину литической единицы комплемента для полного
лизиса. По этой причине определяют единицу 50%-ного лизиса >(СН50) в